楊春蕾，池晶晶，張　莉，路　超，王利麗，任衛(wèi)科

(天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300382)

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天津部分豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌的分離鑒定

楊春蕾，池晶晶*，張莉，路超，王利麗，任衛(wèi)科

(天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300382)

摘要：為了解天津部分地區(qū)2014年副豬嗜血桿菌病的發(fā)病情況及菌株的致病力，收集本地區(qū)45個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)疑似副豬嗜血桿菌病豬的病料53份，通過(guò)病原分離培養(yǎng)、培養(yǎng)特性及染色特性觀察、生化試驗(yàn)及PCR擴(kuò)增等方法進(jìn)行鑒定，最終分離到陽(yáng)性樣品15例，陽(yáng)性率28.3%；挑選2株(TJ-0121A，TJ-0134A)分離于臨床癥狀典型病豬，且生物學(xué)特性典型的分離株進(jìn)行豚鼠副豬嗜血桿菌的人工感染試驗(yàn)，每只豚鼠腹腔注射2.0×109 CFU/mL菌液。TJ-0121A分離株接種豚鼠后，豚鼠全部死亡；TJ-0134A分離株感染7 d后未出現(xiàn)死亡。對(duì)所有豚鼠的肝、肺、脾、淋巴結(jié)、腎、心肌進(jìn)行副豬嗜血桿菌分離和PCR檢測(cè)，TJ-0121A組死亡豚鼠的所有組織均可分離并檢測(cè)到副豬嗜血桿菌；TJ-0134A組豚鼠僅肺臟分離檢測(cè)到副豬嗜血桿菌，說(shuō)明不同菌株間的致病力存在差異。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌；豬；分離;鑒定

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPs)為巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，為革蘭陰性、多形態(tài)的短小桿菌，是常規(guī)飼養(yǎng)豬群的上呼吸道中一種常在菌。HPs能感染2周齡～4月齡的豬，主要發(fā)病階段為斷奶前后和保育階段，常見(jiàn)于5周齡～8周齡，發(fā)病率為10%～15%，嚴(yán)重時(shí)病死率達(dá)50%[1]。HPs可引起豬的腹膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和纖維素性漿膜炎等，并可與其他病原如豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)病原混合感染[2-4]。近年來(lái)，該病在豬場(chǎng)的感染率和病死率日漸增高，是危害養(yǎng)豬業(yè)較為嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。本試驗(yàn)收集2014年天津部分地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)的疑似副豬嗜血桿菌病豬病料，通過(guò)對(duì)病原分離培養(yǎng)、培養(yǎng)特性及染色特性觀察、生化試驗(yàn)及PCR擴(kuò)增等進(jìn)行鑒定，并對(duì)2株分離于臨床癥狀典型病豬且生物學(xué)特性典型的分離株進(jìn)行豚鼠副豬嗜血桿菌的人工感染試驗(yàn)，以期了解本地區(qū)的發(fā)病情況和分離菌株的致病力，為天津地區(qū)該病的防控及下一步副豬嗜血桿菌人工感染豚鼠模型建立奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來(lái)源收集2014年天津地區(qū)不同區(qū)縣的45個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)疑似副豬嗜血桿菌病豬病料，無(wú)菌采集53頭病豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等病料。

1.1.2主要試劑和培養(yǎng)基 dNTPs、10×PCR buffer、Taq酶等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；微量生化反應(yīng)鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。巧克力NAD瓊脂平板培養(yǎng)基。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)豚鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集病豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等病料，接種于巧克力NAD瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，選取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，觀察結(jié)果，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2生化試驗(yàn) 將分離得到的疑似菌分別接種D-核糖、木糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨糖、山梨醇、甘露醇、β-半乳糖、脲酶、硫化氫微量生化反應(yīng)管中，同時(shí)在生化鑒定管中加入一定量的NAD，置于培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h～48 h。

1.2.3PCR鑒定 參照HPs 16 S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，下游引物5′-GCGGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，由金唯智生物科技有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為826 bp。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，模板1 μL，rTaq酶0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 7 min;95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán);終末延伸72℃ 10 min。

1.2.4分離株致病力試驗(yàn) 根據(jù)副豬嗜血桿菌的生物學(xué)特性及臨床表現(xiàn)，選用分離病豬臨床癥狀典型并經(jīng)測(cè)序鑒定的兩株分離菌株(TJ-0121A，TJ-0134A)，每組分別按照濃度2.0×109CFU/mL腹腔注射豚鼠各6只，6只對(duì)照組豚鼠注射滅菌生理鹽水。注射后臨床觀察7 d，記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)，記錄豚鼠出現(xiàn)死亡時(shí)間，統(tǒng)計(jì)死亡率，對(duì)死亡豚鼠進(jìn)行剖檢，觀察并記錄各個(gè)組織器官的病變。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡后，無(wú)菌采集肝、肺、脾、淋巴、腎、心肌組織樣品，接種巧克力NAD瓊脂進(jìn)行HPs分離，并使用建立的PCR方法進(jìn)行鑒定，記錄人工感染后的各個(gè)臟器的感染情況。

2結(jié)果

2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

將臨床樣品接種于巧克力NAD瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48 h后，共分離到15株HPs疑似菌株，菌落純化培養(yǎng)，觀察到針尖大小、圓形、灰白色半透明、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落。挑取單個(gè)菌落經(jīng)革蘭染色后在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)革蘭陰性細(xì)小桿菌，且呈球桿狀、長(zhǎng)桿狀、短桿狀及長(zhǎng)絲狀多種不同形態(tài)的菌體。

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果

麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇均為陽(yáng)性；D-核糖、果糖、阿拉伯糖、山梨醇、硫化氫均為陰性；木糖、山梨糖、β-半乳糖、脲酶等反應(yīng)不完全一致。15個(gè)分離株生化試驗(yàn)結(jié)果符合副豬嗜血桿菌的生化特性(表1)。

表1　15個(gè)分離株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3分離株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果

15個(gè)分離株經(jīng)PCR檢測(cè)均擴(kuò)增出大小約為826 bp的目的片段(圖1)。

1.HPS-1;2.HPS-2; 3.HPS-3;4.HPS-4; 5.HPS-5;6.HPS-6;7.HPS-7;8.HPS-8;9.HPS-9;10.HPS-10;11.HPS-11;12.HPS-12;13.HPS-13;14.HPS-14; 15.HPS-15;16.陽(yáng)性對(duì)照;17.空白對(duì)照; M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000

1.HPS-1;2.HPS-2;3.HPS-3;4.HPS-4;5.HPS-5;6.HPS-6;7.HPS-7;8.HPS-8;9.HPS-9;10.HPS-10;11.HPS-11;12.HPS-12;13.HPS-13;14.HPS-14;15.HPS-15;16.Positive control;17.Blank control;M.DNA Marker DL 2 000

圖1分離株P(guān)CR電泳結(jié)果

Fig.1PCR results of isolation strains

2.4分離株致病力試驗(yàn)

將2個(gè)分離株分別接種6只豚鼠，結(jié)果表明，TJ-0121A分離株感染豚鼠6 h后，豚鼠出現(xiàn)精神沉郁、震顫、背毛豎立、相互擁擠，16 h出現(xiàn)死亡，24 h內(nèi)6只豚鼠全部死亡，死亡豚鼠無(wú)任何肉眼可見(jiàn)的臟器病變；TJ-0134A分離株感染豚鼠6 h～24 h，豚鼠表現(xiàn)精神沉郁、行動(dòng)緩慢等癥狀，7 d后未出現(xiàn)死亡，將存活豚鼠進(jìn)行處死，所有處死豚鼠脾臟均可見(jiàn)白色纖維素性滲出，部分豚鼠可見(jiàn)皮下出血、接種部位皮下膿腫，花斑樣腎臟等(圖2～圖5)。

TJ-0121A試驗(yàn)組死亡豚鼠的肝、肺、脾、淋巴結(jié)、腎、心肌組織均分離到副豬嗜血桿菌且PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，TJ-0134A試驗(yàn)組僅肺臟分離到副豬嗜血桿菌且PCR僅肺臟為陽(yáng)性。對(duì)照組未分離到細(xì)菌。

圖2　接種部位膿腫

圖3　脾臟白色滲出物

圖4　皮下出血

圖5　花斑狀腎臟

3討論

由副豬嗜血桿菌引起的疾病已成為導(dǎo)致保育豬死亡的主要原因之一，副豬嗜血桿菌由Glasser于1910年首次報(bào)道，但1922年才首次分離到細(xì)菌，隨著副豬嗜血桿菌病的流行，該病的發(fā)生在世界各地均有報(bào)道[5-6]。副豬嗜血桿菌是一種NAD依賴(lài)型、非溶血性、革蘭陰性多形性桿菌，人工培養(yǎng)時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境要求苛刻[7]。且由于副豬嗜血桿菌是呼吸道的常在菌，培養(yǎng)條件苛刻，故檢出率很低，不易于本菌的分離和鑒定工作的開(kāi)展。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于中等毒力株(血清4型)的感染以胸膜液、腹膜纖維性滲出和積液、肺和心包液為最佳采樣點(diǎn)，強(qiáng)毒力株(血清12型)的感染，以肺、心血、關(guān)節(jié)和腦為最佳采樣點(diǎn)[8]。HPs可引起仔豬多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等全身性感染疾病。病情嚴(yán)重的仔豬病料同時(shí)會(huì)分離到大腸埃希菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌或與副豬嗜血桿菌相似的吲哚放線(xiàn)桿菌、小放線(xiàn)桿菌等細(xì)菌，不易于鑒別和區(qū)分[9]。

本試驗(yàn)收集天津地區(qū)45個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)疑似副豬嗜血桿菌病豬的病料53份，通過(guò)病原分離培養(yǎng)、培養(yǎng)特性及染色特性觀察、生化試驗(yàn)及PCR擴(kuò)增等方法進(jìn)行鑒定，最終分離到陽(yáng)性樣品數(shù)15例，陽(yáng)性率28.3%，說(shuō)明副豬嗜血桿菌病在天津地區(qū)流行廣泛，且發(fā)病率較高，提示該地區(qū)應(yīng)做好副豬嗜血桿菌病的防御措施。

高鵬程等[10]研究表明，豚鼠是對(duì)副豬嗜血桿菌較敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，且用氣管、肺內(nèi)和腹腔注射的感染方式敏感性明顯高于其他的接種途徑，而腹腔感染更為簡(jiǎn)捷、易操作，故本試驗(yàn)挑選2株分離于臨床癥狀典型病豬且生物學(xué)特性典型的分離株進(jìn)行豚鼠副豬嗜血桿菌的人工感染試驗(yàn)。結(jié)果表明，TJ-0121A分離株接種豚鼠后，豚鼠全部死亡，且所有豚鼠的肝、肺、脾、淋巴、腎、心肌均能分離并檢測(cè)到HPs；TJ-0134A分離株感染7 d后未見(jiàn)異常，且僅肺臟分離檢測(cè)到HPs。說(shuō)明不同分離菌株的致病力存在差異。徐惠娟等[11]指出，副豬嗜血桿菌各血清型菌株間的致病力存在較大差異，且還具有明顯的地方性特征，試驗(yàn)中選取的2株分離株致病力存在明顯差異，因此還需進(jìn)一步分析本地區(qū)目前流行的血清型，并有針對(duì)性的開(kāi)發(fā)相應(yīng)血清型疫苗，才能

夠有效的預(yù)防和控制本病的流行。

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Isolation and Identification ofHaemophilusparasuisin Part Pig Farms of Tianjin

YANG Chun-lei，CHI Jing-jing，ZHANG Li，LU Chao，WANG Li-li， REN Wei-ke

(TianjinInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,Tianjin,300382,China)

Abstract:In order to understand the morbidity of Haemophilus parasuis(HPs) infections in Tianjin area and the pathogenicity of isolated strains,53 sick piglet samples were collected from 45 scale pig farms.15 samples were identified as HPs by cultural characters and staining property analysis,biochemical tests and PCR assay,the positive rate reached 28.3%.Two strains(TJ-0121A，TJ-0134A) with typical clinical symptoms and biological characteristics were selected to infect guinea pigs.Each guinea pig was inoculated with 2.0×109 CFU/mL HPs by intraperitoneal injection.The result showed that one group of guinea pigs were all dead after inoculation,and the other group had no obvious symptoms after inocution with TJ-0134A strain 7 days.Isolation and PCR assay were adopted to detect HPs from liver,lung,spleen,lymph nodes,kidney,heart muscle of guinea pigs,HPs existed in all tissues of dead guinea pigs inoculated with TJ-0121A strain, and the HPs were only detected in lungs of guinea pigs inoculated with TJ-0134A strain.The result indicated that different pathogenicities existed with different strains.

Key words:Haemophilus parasuis;pig;isolation;identification

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0063-04

中圖分類(lèi)號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：楊春蕾(1986-)，女，天津人，實(shí)習(xí)研究員，碩士,主要從事動(dòng)物病原微生物學(xué)研究。 *通訊作者

基金項(xiàng)目：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目(11013)

收稿日期：2015-04-12