徐玉智，李淑芳，張培君，龔玉梅，王宏俊*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866)

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副豬嗜血桿菌HigB和HigA基因的原核表達(dá)及功能分析

徐玉智1，2，李淑芳1，張培君1，龔玉梅1，王宏俊1*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866)

摘要:副豬嗜血桿菌屬于條件性致病菌，可引起豬的格拉澤病，表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。毒素抗毒素系統(tǒng)(TA)廣泛存在于細(xì)菌中,其參與各種應(yīng)激狀態(tài)下的生理調(diào)節(jié)，利于機(jī)體適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境?？寺【幋a副豬嗜血桿菌的HigBA毒素抗毒素蛋白的基因，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)和分析鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HigB對(duì)生長(zhǎng)有抑制作用，而HigA可以中和這種作用，HigBA構(gòu)成一對(duì)毒素抗毒素系統(tǒng)。HigB在高溫和高密度時(shí)，表達(dá)量顯著增加，顯示其參與逆境環(huán)境下的生理調(diào)控。

關(guān)鍵詞:副豬嗜血桿菌; HigBA; 生長(zhǎng)抑制試驗(yàn); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

典型的TA系統(tǒng)包括穩(wěn)定的毒素和不穩(wěn)定的抗毒素，毒素與抗毒素形成復(fù)合物，抑制毒素的生理功能，在一定的條件下，不穩(wěn)定的抗毒素被降解，毒素通過(guò)斷裂特定的mRNA而發(fā)揮生理調(diào)控功能[1-2]。TA系統(tǒng)最早在一些低拷貝的質(zhì)粒中被發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌分裂時(shí)如果丟失質(zhì)粒，細(xì)菌不能生長(zhǎng)，從而可以保證質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳，因而質(zhì)粒中的TA系統(tǒng)又叫做質(zhì)粒穩(wěn)定元素。對(duì)基因組中的TA系統(tǒng)功能還知之甚少，可能與質(zhì)粒中的TA系統(tǒng)有相似的功能，它們很可能參與穩(wěn)定基因組中的基因組分或者作為壓力反應(yīng)元素，調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)或死亡[3-4]。

根據(jù)毒素的屬性和它們之間的相互作用方式，TA系統(tǒng)可以分為5種類型。在所有類型中，毒素都是蛋白，抗毒素可能是蛋白(Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型)或者是RNA(Ⅰ、Ⅲ型)。在Ⅰ型中，抗毒素通過(guò)黏附毒素mRNA來(lái)抑制毒素;在Ⅱ和Ⅲ型中，抗毒素蛋白和抗毒素RNA直接黏附毒素蛋白;在Ⅳ型中，抗毒素修飾保護(hù)毒素作用位點(diǎn);在Ⅴ型中，抗毒素是mRNA酶特異的裂解毒素的mRNA[5-6]。HigBA毒素-抗毒素系統(tǒng)屬于Ⅱ型，其特點(diǎn)是毒素與抗毒素都是蛋白，通過(guò)形成毒素-抗毒素復(fù)合物，抑制毒素功能。HigBA首先在Rst1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)，然后在銅綠假單胞菌、耐甲氧芐青霉素金黃色葡萄球菌等基因組中發(fā)現(xiàn)[7]。HigB毒素屬于RelE家族，在結(jié)核分支桿菌中證明HigB具有翻譯依賴的mRNA酶活性,在重組大腸埃希菌中表達(dá)可以抑制其生長(zhǎng)。在適宜的環(huán)境，HigA與HigB結(jié)合成無(wú)毒的復(fù)合物，并且HigA可以結(jié)合到HigBA操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域，阻止HigBA轉(zhuǎn)錄，從而HigB不表現(xiàn)出活性，并且HigBA操縱子不進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在應(yīng)激狀態(tài)下，如氨基酸缺乏、高溫、高密度、氧脅迫等情況下，HigA被Lon或Clp蛋白酶降解，HigB表現(xiàn)出活性，并且HigBA操縱子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[8]。在巴斯德桿菌屬杜克雷嗜血桿菌和巴斯德桿菌目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TA系統(tǒng)，流感嗜血桿菌含有6個(gè)TA系統(tǒng)[9]。與流感嗜血桿菌TA系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌也含有HigBA毒素抗毒素系統(tǒng)。本研究對(duì)副豬嗜血桿菌的HigBA毒素抗毒素系統(tǒng)進(jìn)行了初步驗(yàn)證，證明其參與逆境下生理調(diào)控。研究結(jié)果為副豬嗜血桿菌染色體上其他TA系統(tǒng)的鑒定及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株pGM-T載體、pET30a表達(dá)載體、TOP10、BL21(DE3)、BL21(DE3)plyss，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pETduet雙表達(dá)載體，武漢淼靈生物科技有限公司產(chǎn)品；副豬嗜血桿菌5型標(biāo)準(zhǔn)株，澳大利亞昆士蘭動(dòng)物研究所Pat博士惠贈(zèng)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院高新技術(shù)研究室保存；15個(gè)副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，澳大利亞昆士蘭研究所Pat惠贈(zèng)；副豬嗜血桿菌分離株，本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.1.2主要試劑T載體試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、卡那霉素、氨芐霉素、DNA Marker DL 2 000；Color prestained protein marker、IPTG，北京天根生化科技公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶,TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶，NEB公司產(chǎn)品；蛋白純化試劑盒，Roche公司產(chǎn)品，包含純化柱子、LysisⅠ、LysisⅡ、WashⅠ、WashⅡ、Elution等；TSA固體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1HigB、HigA重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1.1PCR擴(kuò)增以副豬嗜血桿菌5型標(biāo)準(zhǔn)株DNA為模板，根據(jù)副豬嗜血桿菌HigB、HigA基因序列(Gene ID：7276935和7276936)，分別設(shè)計(jì)引物對(duì)primers1，primers2(表1)，用來(lái)克隆HigB和HigA。 primers1 用于純化HigB，Permers4 用于生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，Permers5 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分別標(biāo)為HigB1、2、3。

PCR反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL，模板1 μL，2×PCR StarMix 10μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，59 ℃ 45 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1　本試驗(yàn)所用引物

1.2.1.2酶切轉(zhuǎn)化用BamHⅠ和HindⅢ酶切pET30a質(zhì)粒和HigB、HigA的PCR產(chǎn)物，T4 DNA連接酶連接，分別轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)plyss和BL21(DE3)表達(dá)菌株，篩選陽(yáng)性克隆，分別命名BL21plyss-pET30a-HigB和BL21-pET30a-HigA。

1.2.2HigB、HigA誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定分別挑取BL21plyss-pET30a-HigB和BL21-pET30-HigA單菌落，接入LB培養(yǎng)基(Kna濃度25 μg/mL)，過(guò)夜，次日1∶100接入新鮮的LB培養(yǎng)基(Kna抗性)，培養(yǎng)至OD 600 nm=0.6，加IPTG(終濃度1 mmol/L)，誘導(dǎo)4 h。收集菌體，取樣進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.3HigB、HigA純化 按試劑盒說(shuō)明操作，即誘導(dǎo)表達(dá)1 L菌液，4℃超聲離心菌液，用LysisⅠ清洗。將沉淀懸浮于LysisⅡ中，4℃離心裂解的菌體。用平衡后的5 mL His標(biāo)簽Ni-瓊脂糖與上清混合，4 ℃攪拌過(guò)夜。將樣品與Ni-瓊脂糖填料混合物裝柱，用5倍Ni-瓊脂糖填料體積的WashⅠ、WashⅡ和Elution沖洗柱子，分別收集流穿液。收集的流穿液進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析,所用的一抗為兔抗副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清(本實(shí)驗(yàn)室保存)，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG, HRP Conjugated 康為世紀(jì))。

1.2.4生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

1.2.4.1重組質(zhì)粒構(gòu)建利用引物Primers4(表1)擴(kuò)增HigB并插入pETduet質(zhì)粒，利用引物primers4和primers1(表1)分別擴(kuò)增HigB和HigA并同時(shí)插入pETduet質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3)，分別命名為BL21Duet-HigB和BL21Duet-HigBA。

1.2.4.2大腸埃希菌生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)重組大腸埃希菌BL21 Duet-HigB生長(zhǎng)至OD 600 nm=0.4時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，每小時(shí)測(cè)1次OD，繪制生長(zhǎng)曲線,記作生長(zhǎng)曲線1；重組大腸埃希菌BL21 Duet-HigB生長(zhǎng)至OD 600 nm=0.4時(shí)，不加1 mmol/L IPTG，每小時(shí)測(cè)一次OD，繪制生長(zhǎng)曲線,記作生長(zhǎng)曲線2；重組大腸埃希菌BL21 Duet-HigBA生長(zhǎng)至OD 600 nm=0.4時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，每小時(shí)測(cè)一次OD，繪制生長(zhǎng)曲線，記作生長(zhǎng)曲線3。

1.2.5real-time PCR用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析HigB在高溫和高密度條件下的表達(dá)差異，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物Primers5、6，由華大基因科技有限公司合成。

1.2.5.1real-time PCR樣品挑取5型副豬嗜血桿菌單菌落加入TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后按照1∶50接入新鮮液體培養(yǎng)基中。設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組：C組 37 ℃，培養(yǎng)6 h，作為對(duì)照組；B組40 ℃，培養(yǎng)6 h，作為高溫組；A組 37 ℃，培養(yǎng)9 h，作為高密度組。分別收集處理后的3組樣品，用Trizol方法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.5.2real-time PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：H2O 6.6 μL，2×PCR Mix 8 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。

2結(jié)果

2.1副豬嗜血桿菌HigB和HigA基因擴(kuò)增

用5型標(biāo)準(zhǔn)株作為模板，用引物Primers1，Primers2，分別擴(kuò)增HigB和HigA基因，目的片段大小分別是279 bp和273 bp(圖1)。

1.HigA陰性對(duì)照；2.HigA PCR產(chǎn)物；3.HigB陰性對(duì)照;4.HigB PCR產(chǎn)物；M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000

1.Negative control of HigA; 2.PCR products of HigA; 3.Negative control of HigB;M.DNA Marker DL 2 000

圖1HigB和HigA PCR擴(kuò)增

Fig.1PCR amplication of HigB and HigA

2.2副豬嗜血桿菌HigB和HigA原核表達(dá)與純化

重組BL21plyss-pET30a-HigB菌株和重組BL21-pET30a-HigA菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行純化(圖2和圖3)。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，兔抗副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清與HigB和HigA蛋白反應(yīng)(圖4)。

2.3生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果

重組大腸埃希菌BL21 Duet-HigB加IPTG誘導(dǎo)后，OD值沒(méi)有隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，而是維持在0.5左右；而未加IPTG的重組大腸埃希菌BL21 Duet-HigB，OD值明顯升高，生長(zhǎng)曲線差異明顯。并且重組大腸埃希菌BL21 Duet-HigBA加IPTG誘導(dǎo)組與未加IPTG誘導(dǎo)的重組大腸埃希菌BL21 Duet-HigB，生長(zhǎng)曲線差異不明顯(圖4)。表明HigB蛋白能夠抑制大腸埃希菌生長(zhǎng)，HigA蛋白可以中和HigB蛋白的抑制作用，初步鑒定出HigB和HigA蛋白構(gòu)成一對(duì)毒素抗毒素系統(tǒng)。

2.4real-time PCR結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析HigB表達(dá)情況，高溫組和高密度組HigB mRNA表達(dá)量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.01)(圖5)。說(shuō)明在不適環(huán)境下，大腸埃希菌HigB mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.未誘導(dǎo)的BL21plyss-PET30a；2.未誘導(dǎo)的BL21plyss-pET30a-HigB對(duì)照；3.誘導(dǎo)后的BL21plyss-pET30a-HigB全菌；4.誘導(dǎo)后的BL21plyss-pET30a-HigB上清；5.誘導(dǎo)后的BL21plyss-pET30a-HigB沉淀；6.未誘導(dǎo)的BL21-PET30a；7.未誘導(dǎo)的BL21-pET30a-HigA對(duì)照； 8.誘導(dǎo)后的BL21-pET30a-HigA全菌；9.誘導(dǎo)后的BL21-pET30a-HigA上清； 10.誘導(dǎo)后的BL21-pET30a-HigA沉淀

M.Protein molecular weigh Marker;1.Uninduced BL21plyss-PET30a;2.uninduced BL21plyss-pET30a-HigB control;3.Induced products of BL21plyss-pET30a-HigB；4.Supernatant of induced products BL21plyss-pET30a-HigB;5.Precipitation of induced products BL21plyss-pET30a-HigB;6.Uninduced BL21-PET30a;7.Uninduced BL21-PET30a-HigA control;8.induced products of BL21-pET30a-HigA;9.Precipitation of induced products BL21-pET30a-HigA;10.Precipitation of induced products BL21-pET30a-HigA

圖2純化后的HigB和HigA蛋白

Fig.2Purified proteins of HigB and HigA

3討論

重組大腸埃希菌BL21(DE3)-pET30a-HigB誘導(dǎo)后，進(jìn)行純化，流穿液進(jìn)行SDS-PAGE電泳看不到明顯的目的條帶，可能是由于表達(dá)量低。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3)plyss菌株，構(gòu)建BL21(DE3)plyss-pET30a-HigB重組大腸埃希菌，SDS-PAGE電泳可以看見(jiàn)明顯的純化條帶?？赡芤?yàn)锽L21(DE3)plyss菌株可以降低目的基因的背景表達(dá)，更適合表達(dá)有毒性的蛋白。

近年來(lái)，副豬嗜血桿菌的感染引起了豬的高發(fā)病率和高病死率，已給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[10]。然而，關(guān)于副豬嗜血桿菌在豬體內(nèi)生長(zhǎng)適應(yīng)性和引起疾病的機(jī)理還不是很清楚。有研究表明，流感嗜血桿菌[11]和鮑曼不動(dòng)桿菌[12]的TA系統(tǒng)有助于其在宿主體內(nèi)滯留。副豬嗜血桿菌在豬體內(nèi)滯留進(jìn)而引起疾病，很可能也與TA系統(tǒng)有關(guān)。我們的結(jié)果證明，副豬嗜血桿菌HigBA構(gòu)成一對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)，在逆境環(huán)境下參與生理調(diào)控。副豬嗜血桿菌寄生在呼吸道，需要面臨復(fù)雜的環(huán)境。TA系統(tǒng)的存在，在mRNA水平進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，能使其對(duì)外界環(huán)境進(jìn)行快速反應(yīng)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.純化的HigA蛋白;2.純化的HigB蛋白

M.Protein molecular weight Marker;1.Purified protein of HigA;

2.Purified protein of HigB

圖3純化的HigB和HigA蛋白

Fig.3Purified protein of HigB and HigA

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化的HigA蛋白；2.純化的HigB蛋白

M.Protein molecular weigh Marker;1.Purified protein of HigA;2.Purified protein of HigB

圖4純化的HigB和HigA蛋白的Western blot 分析

Fig.4Western blot analysis of purified proteins HigB and HigA

圖5　 重組大腸埃希菌生長(zhǎng)曲線

圖6　 HigB的mRNA相對(duì)表達(dá)量

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Prokaryotic Expression and Function Analysis ofHaemophilusparasuisHigB and HigA Genes

XU Yu-zhi1,2,Li Shu-fang1,ZHANG Pei-jun1,GONG Yu-mei1,Wang Hong-jun1

(1.BeijingInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,BAAFS,BeijingMunicipalKeyLaboratoryofAnimalDieasePreventionandControlTechnology,Beijing,100097,China；2.CollegeofBiologicalTechnology,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China)

Abstract:Haemophilus parasuis is a conditional pathogenic bacterium,and could cause swine Glaser's disease,which is manifested as polyserositis and arthritis.TA system widely exists in bacteria,which involves in physiological regulation in stress states for adapting to complex environment.There are few reports about the TA system of Haemophilus parasuis,so the genes of HigB and HigA were screened and cloned,and then they were expressed and identified in prokaryotic expression system.The results showed that,HigBA is a pair of toxin-antitoxin system,in which HigB could inhibit the growth,while HigA could neutralize this effect.The expression of HigB was significantly increased at high temperature and high density,which indicated that it participated in the physiological regulation of stress.

Key words:Haemophilus parasuis;HigBA;growth inhibition test; qRT-PCR

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0059-05

中圖分類號(hào):S852.612;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：徐玉智(1990-)，男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究。 *通訊作者

基金項(xiàng)目：北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目(KJCX20140410)；“863”子課題(2011AA10A210)；北京市農(nóng)林科學(xué)院“雙百對(duì)接”項(xiàng)目

收稿日期：2015-08-04