郭定宗,鄒　苗,萬春云,張　韋,郭　銳,楊世錦

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430070；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430064)

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石首麋鹿致病性大腸埃希菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

郭定宗1,鄒苗1,萬春云1,張韋1,郭銳2,楊世錦1

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430070；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430064)

摘要:湖北石首麋鹿國家級自然保護(hù)區(qū)是我國三大麋鹿保護(hù)基地之一，自然放養(yǎng)狀態(tài)的麋鹿易受到大腸埃希菌侵襲并導(dǎo)致死亡。為了弄清石首麋鹿保護(hù)區(qū)內(nèi)麋鹿大腸埃希菌感染和流行現(xiàn)狀，以及致病性和主要毒力因子，通過藥敏試驗(yàn)、生化鑒定、16 S rDNA PCR、小鼠毒力試驗(yàn)等方法從病料中分離到15株致病性大腸埃希菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離到的15株大腸埃希菌對慶大霉素、卡那霉素、頭孢唑啉的敏感度均達(dá)到了100%；其次是對氯霉素、新霉素以及鏈霉素敏感度均超過60%；耐藥性方面，對克林霉素和磺胺嘧啶的耐藥度分別為80%和60%。毒力因子PCR結(jié)果顯示，主要毒力因子為ompA(100.00%)、traTa(80.00%)、iss(80.00%)、iucD(60.00%)、irp2(53.33%)、sta(33.33%)、cva/cvi(26.67%)、vat(20.00%)。

關(guān)鍵詞:致病性大腸埃希菌； 麋鹿；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)；毒力因子

麋鹿是原產(chǎn)于我國的國家一級重點(diǎn)保護(hù)動物，現(xiàn)有3個自然保護(hù)區(qū)，湖北石首麋鹿保護(hù)區(qū)是最大的麋鹿自然保護(hù)區(qū)之一。保護(hù)區(qū)自1991年建立以來，區(qū)內(nèi)環(huán)境改變明顯，由于保護(hù)區(qū)內(nèi)天鵝洲故道圍堤的修建以及三峽大壩蓄水，使保護(hù)區(qū)段水位較低、溝渠缺水并且無法流動，導(dǎo)致靜水水體污染加劇、富營養(yǎng)化，麋鹿喜水，增加了麋鹿遭受病原菌感染的風(fēng)險[1-3]。

大腸埃希菌是最常見的可由污染水體傳播的病原菌，水傳播是其重要的傳播方式[4]。袁碩峰[5]曾對石首麋鹿保護(hù)區(qū)送檢的死亡雄性麋鹿進(jìn)行了致病菌分離，經(jīng)過16 S rDNA基因序列分析，認(rèn)定分離到的3株大腸埃希菌均為麋鹿源致病性大腸埃希菌。此外，近年來多處發(fā)現(xiàn)鹿源性大腸埃希菌，大腸埃希菌已成為引起麋鹿發(fā)病和死亡的主要病原[6-7]。

為弄清石首麋鹿保護(hù)區(qū)內(nèi)麋鹿大腸埃希菌感染和流行現(xiàn)狀，以及致病性和主要毒力因子，本試驗(yàn)從麋鹿病料中分離大腸埃希菌，通過染色鏡檢、生化鑒定、16 S rDNA PCR、毒力因子PCR鑒定以及小鼠致病性試驗(yàn)等對其進(jìn)行鑒定，其結(jié)果如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料、試劑和實(shí)驗(yàn)動物病料采自湖北石首麋鹿自然保護(hù)區(qū)；SS瓊脂等培養(yǎng)試劑,購自杭州微生物試劑有限公司；氧化酶試紙、O-F發(fā)酵管、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管(第二代15e系統(tǒng))、弧菌科生化編碼鑒定管(GY-9V系統(tǒng))及非發(fā)酵生化編碼鑒定管,均購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片的種類包括氨芐西林、頭孢唑啉(先鋒V)、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星(氟哌酸)、恩諾沙星、PHENICOLS(氯霉素)、克林霉素(氯潔霉素)、氟苯尼考，均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR中TaqDNA Reaction buffer、TaqDNA 聚合酶、dNTPS、DNA Marker (DL 2 000),購自武漢天根生物有限公司。昆明小鼠50只，雌雄各半，3周齡，體重20 g～22 g，購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2引物所有引物均由擎科(武漢)生物技術(shù)有限公司合成。毒力基因擴(kuò)增引物的序列、基因的片段大小及退火溫度見表1。

16 S rDNA擴(kuò)增通用引物：上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ,下游引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。毒力因子的測定引物見表1。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離與純化無菌采集死亡麋鹿病料及新鮮糞便，并劃線接種于胰蛋白胨大豆蛋白胨(TSA)培養(yǎng)基與伊紅-美藍(lán)(EMB)培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)，18 h后挑取典型菌落接種到MH肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床以220 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)8 h，重復(fù)上述步驟，確保分離到純化菌株，等體積與300 g/L甘油混合均勻，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　致病性大腸埃希菌毒力因子擴(kuò)增引物

挑取純化培養(yǎng)的單菌落，革蘭和瑞特染色，于高倍油鏡下觀察單個細(xì)菌形態(tài)及著色情況，對細(xì)菌進(jìn)行初步分類，確定生化鑒定管的選擇使用。

1.2.2分離菌株的生理生化試驗(yàn)按照細(xì)菌純培養(yǎng)物的革蘭染色、氧化酶試驗(yàn)、O-F試驗(yàn)是否為陽性，選擇相應(yīng)生化鑒定系統(tǒng)接種細(xì)菌，于37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察判定生化反應(yīng)結(jié)果，并檢索對應(yīng)的生化鑒定編碼手冊及參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第8版》標(biāo)準(zhǔn)，判定細(xì)菌種類。

1.2.3分離菌株的16 S rDNA PCR鑒定對生化鑒定編碼檢索中，出現(xiàn)重碼，即同一個編碼出現(xiàn)2個～3個鑒定結(jié)果的情況，本次調(diào)查采取16 S rDNA方法鑒定細(xì)菌種屬。 反應(yīng)在50 μL 體系中進(jìn)行：10×PCR緩沖液5.0 μL；dNTP 1.0 μL；上下游引物各1.0 μL；模板DNA 2.0 μL；TaqDNA 聚合酶1.0 μL；ddH2O 39 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min ;94℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)； 72℃ 10 min。按Omega膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行膠回收。按TaKaRa公司pMD18-T載體說明書，將純化的PCR產(chǎn)物連接到載體上。按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coliDpα感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選培養(yǎng)后送菌液至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。根據(jù)測序結(jié)果在GenBank上利用Blast進(jìn)行序列的同源性分析。

1.2.4分離菌株對小鼠致病性試驗(yàn)供試驗(yàn)的小鼠，試驗(yàn)前禁食、禁水24 h。試驗(yàn)小鼠用注射器腹腔注射活菌菌液0.2 mL/只(約含細(xì)菌2×109CFU)，每組2只小鼠，對照組注射無菌生理鹽水，劑量和方法同試驗(yàn)組。攻毒后，將不同組別的小鼠分籠飼養(yǎng)，并每天觀察小鼠的臨床表現(xiàn)，包括小鼠的精神狀態(tài)、食欲等臨床表現(xiàn)，連續(xù)觀察72 h，并對各組小鼠的發(fā)病和死亡情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。

1.2.5分離菌株的藥敏試驗(yàn)將待檢菌液接種于普通營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)6 h，用無菌棉拭子沾取菌液，在普通瓊脂平板上沿一個方向均勻涂抹，然后將平皿轉(zhuǎn)動60°，共涂布3次。加蓋后放置5 min，用無菌鑷子將藥敏片平放在平板上，并輕壓使其緊貼在平板表面。藥敏試紙見每個平板貼紙片5張，貼好紙片的平板于37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察結(jié)果。

1.2.6分離細(xì)菌PCR模板的制備將15株大腸埃希菌分離株分別在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，取1.5 mL菌液于無菌的EP管，12 000 r/min離心2 min，沉淀加300 μL去離子水，渦旋混勻。然后煮沸變性10 min，立即放入冰浴中，12 000 r/min離心數(shù)秒后取上清作為DNA模板。

1.2.7毒力基因的PCR檢測25 μL PCR體系包含:10×TaqDNA Reaction buffer 2.5 μL、2.5 U/μL的高保真TaqDNA聚合酶0.8 μL，10 mmol/L dNTPS 0.5 μL，10種毒力基因上、下游引物(10 μmol/L)分別各1 μL，模板DNA4 μL，ddH2O加至總體系25 μL。分別以優(yōu)化后的條件對致病菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃ 3 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25次循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠用80 V電壓電泳40 min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

2結(jié)果

2.1死亡麋鹿剖檢觀察

死亡麋鹿多伴有天然孔出血癥狀，通過對死亡

麋鹿臟器等病料的觀察，發(fā)現(xiàn)血管斷端流出紅褐色凝固不良的血液，且多伴有皮下出血；肺部常有出血灶，且有明顯的炎性滲出物，胸腔內(nèi)積血；腸道大量出血，腹腔有大量血性腹水(圖1)。

2.2細(xì)菌形態(tài)觀察

分別挑取不同瓊脂平板上單個菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢可見有粗短、兩端鈍圓的小桿菌，長1 μm ～3 μm，寬約0.4 μm ～0.7 μm，多單個散在，個別成雙排列，無芽胞，革蘭陰性。分離出的大腸埃希菌在伊紅-美蘭瓊脂上呈現(xiàn)紫黑色金屬光澤的圓形菌落，在麥康凱瓊脂上生長出邊緣整齊、稍隆起、表面光滑濕潤、直徑1 mm～3 mm、粉紅色的圓形菌落，在TSA瓊脂上形成圓形凸起，光滑、濕潤、半透明，近似灰白色的菌落，以上觀察結(jié)果(圖2)符合大腸埃希菌的形態(tài)特征。 A.死后鼻腔出現(xiàn)大量血色泡沫；B、C.分別為死后肺脹和腸道病變

A.Large number of bloody foams occurred in the nose after death；B，C.Pathological lesions in lung and intestine respectively

圖1死亡麋鹿的基本特征

Fig.1The main characteristics of dead deer

A、B、C分別是鏡下形態(tài)、麥康凱和伊紅-美蘭瓊脂上生長形態(tài)

A means the morphology under the microscope,B and C mean the mrophologies on the medium of MacConkey agar and eosin-methylene blue medium

圖2大腸埃希菌的典型特征

Fig.2The typical characteristics ofE.coli

2.3細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

參照《腸桿菌科生化鑒定編碼手冊》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第8版》對從死亡麋鹿病料及糞便中分離到的細(xì)菌通過微量生化鑒定管進(jìn)行細(xì)菌的生理生化特性鑒定。結(jié)果表明，分離到15株(E01-E15)符合大腸埃希菌的典型生化特征(表2)。

2.4細(xì)菌16 S rDNA鑒定結(jié)果

對病料分離得到的兩株(E09、E12)出現(xiàn)生化鑒定重碼(一個編碼對應(yīng)兩種以上細(xì)菌)進(jìn)行16 S rDNA補(bǔ)充鑒定。通過測定其16 S rDNA序列，經(jīng)與GenBank中數(shù)據(jù)做Blast比對，與E.coliSE11 DNA的同源性最為接近，達(dá)99%，結(jié)合生化反應(yīng)結(jié)果,判定2株待檢菌為大腸埃希菌。

表2　大腸埃希菌生化鑒定結(jié)果

2.5小鼠致病力試驗(yàn)

小鼠在接種0.2 mL(約含細(xì)菌2×109CFU)的純培養(yǎng)菌液后，先后表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，食欲降低，同時伴隨有抽搐、顫抖等神經(jīng)癥狀。注射生理鹽水的對照組小鼠，精神狀態(tài)與飲水進(jìn)食均表現(xiàn)正常。感染組小鼠在感染后的8 h～72 h陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病和死亡。對死亡小鼠進(jìn)行剖檢后肉眼觀察到的病理變化有：皮下出血，肝臟暗紅色，脾臟腫大，暗黑色，易碎，部分小鼠胃內(nèi)充滿白色黏稠液體，小腸有明顯的腸腔積液及粘連，整體顏色發(fā)暗，部分有膿狀物。采集心血接種培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌回歸檢測，鑒定結(jié)果一致，陽性率為100%。小鼠致病試驗(yàn)表明15株大腸埃希菌能引起小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和實(shí)質(zhì)器官的病理變化，從小鼠實(shí)質(zhì)器官中能分離到大腸埃希菌，結(jié)合生化鑒定判定該15株大腸埃希菌為致病性大腸埃希菌。

2.6大腸埃希菌毒力基因檢測結(jié)果

目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，15株大腸埃希菌分別在919、460、309、201、981、412、1 200、714 bp的位置出現(xiàn)了目的條帶(圖3)。這些片段對應(yīng)與ompA、traTa、iss、sta、vat、irp2、cva、iucD基因擴(kuò)增片段大小一致。15株致病性大腸埃希菌中，ompA毒力基因檢出率為(15/15，100.00%)，traTa毒力基因檢出率為(12/15，80.0%)，iss毒力基因檢出率為(12/15，80.00%)，sta毒力基因檢出率為(5/15，33.33%)，vat毒力基因檢出率為(3/15，20.00%)，irp2毒力基因檢出率為(8/15，53.33%)，cva/cvi毒力基因檢出率為(4/15，26.67%)，iucD毒力基因檢出率為(9/15，60.00%)。在本試驗(yàn)中，總共檢測了12種毒力基因，但只檢出了ompA、traTa、iss、sta、vat、irp2、cva/cvi、iucD等8種，tsh、fimH、Kps II、papC等4種毒力基因未檢出，即這4種毒力基因的檢出率均為0(0/15)。

2.7藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示，分離的15株大腸埃希菌對慶大霉素、卡那霉素、頭孢唑啉的敏感度均達(dá)到了100%；其次是對氯霉素、新霉素以及鏈霉素，敏感度均超過60%；對環(huán)丙沙星和諾氟沙星、恩諾沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、氨芐西林等藥物表現(xiàn)出一定敏感性，但敏感度低于50%的藥物有對環(huán)丙沙星和諾氟沙星、恩諾沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、氨芐西林等藥物。中敏度最高的為氟苯尼考及紅霉素，分別為80.00%及53.33%。以耐藥性來看，15株大腸埃希菌對克林霉素和磺胺嘧啶的耐藥性最高，分別達(dá)到了80.00%和60.00%。

A～L.ompA,traTa,iss,sta,vat,irp2,cva,iucD,vat,irp2,cva/cvi,iucD

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～n.樣品

M.DNA Marker;1-n.Samples

圖3大腸埃希菌毒力基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

Fig.3The electrophoresis result of PCR products of virulence genes ofE.coli

3討論

本調(diào)查在對死亡麋鹿病料進(jìn)行細(xì)菌分離時，除了分離到的15株致病性大腸埃希菌外，還分離到了沙門菌4株、奇異變形桿菌3株、金黃色葡萄球菌3株、銅綠假單胞菌2株、臭鼻克雷伯菌1株。由于沒有進(jìn)行相應(yīng)的小鼠毒性試驗(yàn)，無法判定其致病力，但至少說明了復(fù)合感染這種可能性的存在。此外，通過水體培養(yǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)，可對保護(hù)區(qū)內(nèi)各水源點(diǎn)(2處池塘水域、2處故道水域、1處封閉水溝)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)故道水域的細(xì)菌總數(shù)明顯少于池塘與溝渠。這在一定程度上反映了封閉的水域較開放水域更容易導(dǎo)致細(xì)菌的孳生。張樹苗等[3]指出，自然水域中大腸埃希菌及嗜水氣單胞菌等環(huán)境常在菌，在天氣條件突變、水質(zhì)變差等導(dǎo)致麋鹿免疫力下降時，會成為導(dǎo)致麋鹿迅速大量死亡的致病菌。因此，對于保護(hù)區(qū)內(nèi)的水塘，應(yīng)當(dāng)做到杜絕其他任何家養(yǎng)動物的糞便排入，對于封閉水溝應(yīng)當(dāng)做到及時填埋或與故道貫通形成水渠，降低麋鹿通過飲水途徑遭受條件致病菌威脅的可能性。

細(xì)菌分離培養(yǎng)階段，在培養(yǎng)基的選擇上，初期使用的麥康凱瓊脂平板，發(fā)現(xiàn)其上生長的典型桃紅色菌落與下一階段的生化鑒定結(jié)果不一致，出現(xiàn)了假陽性情況，后改用伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基，這一情況得到極大改善。16 S rDNA是鑒定細(xì)菌種屬最有效的方式[8-9]，該檢測法通過PCR擴(kuò)增、測序、比對等幾個步驟來鑒定細(xì)菌種屬，便于大批量操作，在當(dāng)前已經(jīng)越來越受歡迎，試驗(yàn)采用16 S rDNA檢測法對生化鑒定出現(xiàn)重碼(一個編碼對應(yīng)兩種以上細(xì)菌)的細(xì)菌進(jìn)行了補(bǔ)充鑒定。

對于小鼠毒力試驗(yàn)，由于只是記錄了小鼠的臨床癥狀、病理變化及死亡時間，而沒有測定每株大腸埃希菌的半數(shù)致死量，因此無法對不同株大腸埃希菌的毒力差異進(jìn)行研究。不過鑒于大腸埃希菌的致病性與毒力因子關(guān)系密切，毒力因子的種類決定了所致疾病的種類及嚴(yán)重程度。此外，本研究通過玻片凝集試驗(yàn)對15株致病性大腸埃希菌的O抗原進(jìn)行了檢測，其中2株為O20，1株為O154，為常見致病性大腸埃希菌血清型，其余12株未能確定血清型，定型株比例(3/15)顯著低于梅妹等對東北地區(qū)鹿源大腸埃希菌血清型調(diào)查的O抗原定型株比例，這可能與本調(diào)查的樣本數(shù)較少有關(guān)，但也可能反映了鹿源大腸埃希菌O抗原新血清型的出現(xiàn)[6]。

外膜蛋白、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、黏附素、毒素等多種毒力因子與大腸埃希菌的侵襲力和致病性息息相關(guān)，是其主要的致病因子[10-14]。試驗(yàn)對這些毒力因子進(jìn)行了PCR擴(kuò)增檢測。ompA作為質(zhì)粒編碼的外膜蛋白，其在致病過程中起著重要作用、cvi、traTa、iss作為血清類毒力因子，其檢出的比例較高，APEC能夠產(chǎn)生空泡毒素(Vat)，該毒素對蛋白水解酶及熱穩(wěn)定性方面與幽門螺桿菌的空泡形成毒素(VacA)相似，能夠使成熟的蛋白運(yùn)送至細(xì)胞表面。iss基因在禽致病性大腸埃希菌中所占比例在80%以上，但與人源致病性大腸埃希菌的相關(guān)性較低[15]，而在鹿源大腸埃希菌中檢測到還屬首次。sta基因作為耐熱性腸毒素，是毒力因子檢測的標(biāo)志性基因，本次33.33%的檢出率也說明了其在麋鹿致病機(jī)理中起著重要作用。作為氣桿菌素家族的iucD基因，有研究通過構(gòu)建基因缺失突變株發(fā)現(xiàn)，icuD基因編碼的IucD蛋白與禽大腸埃希菌的致病性有密切關(guān)系。本次對麋鹿致病性大腸埃希菌毒力基因的研究，為進(jìn)一步探討麋鹿大腸埃希菌病的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

從藥敏試驗(yàn)可以看出，分離的15株麋鹿源致病性大腸埃希菌對慶大霉素、卡那霉素、頭孢唑啉有著極高的敏感度，其次是對氯霉素、新霉素以及鏈霉素的敏感度也很高，在一定程度上說明了野生動物源的大腸埃希菌具有較低的耐藥性。但是麋鹿源大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生依然受到兩方面因素的影響，首先保護(hù)區(qū)曾經(jīng)在一段時期內(nèi)出現(xiàn)過養(yǎng)雞、養(yǎng)魚等情況，在上述生產(chǎn)過程中都不可避免地使用過抗菌藥物，導(dǎo)致動物糞便菌叢產(chǎn)生抗藥性，繼而通過麋鹿的采食和飲水等途徑進(jìn)行傳播；另一方面，長江水域濃度嚴(yán)重超標(biāo)的抗菌藥物也長期影響著麋鹿源致病菌的抗藥性。從用藥的性價比來看，同樣具有較好效果的卡那霉素比頭孢唑啉的價格要更為低廉，可以作為麋鹿的臨床用藥參考。但是對于目前石首麋鹿自然保護(hù)區(qū)而言，由于麋鹿常年采食青草，不需要人為補(bǔ)飼，所以對于麋鹿大腸埃希菌病的有效預(yù)防和治療還具有相當(dāng)?shù)碾y度，需要開展進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn):

[1]何振，楊道德，馬建章，等．湖北石首麋鹿的冬季生境選擇[J]．四川動物，2007(4)：764-768．

[2]楊道德，馬建章，何振，等．湖北石首麋鹿國家級自然保護(hù)區(qū)麋鹿種群動態(tài)[J]．動物學(xué)報(bào)，2007，53(6)：947-952．

[3]張樹苗，梁兵寬，張林源，等．我國圈養(yǎng)麋鹿種群發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)及保護(hù)管理對策[J]. 林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2011(2)：128-132．

[4]吳文福，巫月生，賴月輝，等．豬大腸桿菌病的流行特點(diǎn)[J].廣東畜牧獸醫(yī)，2001，26(1)：13-15．

[5]袁碩峰．麋鹿致病性大腸桿菌的分離鑒定[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010(13)：346-347.

[6]梅妹，范君文，鄧旭明，等．長春地區(qū)鹿源性大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(8)：11-15.

[7 ]陶福軍．西豐縣某養(yǎng)鹿場梅花鹿溶血性大腸桿菌病的診療[J]．山東畜牧獸醫(yī)，2011，32(3)：64-65.

[8]Pathipati P,Menon T,Kumar N,et al.Usefulness of 16S rDNA sequencing for the diagnosis of infective endocarditis caused byCorynebacteriumdiphtheriae[J].J Med Microbiol,2012, 61(Pt 8): 1159-1161.

[9]Suzuki R B,Almeida C M.Speranca M A.Absence ofHelicobacterpylorihigh tetracycline resistant 16S rDNA AGA926-928TTC genotype in gastric biopsy specimens from dyspeptic patients of a city in the interior of Sao Paulo, Brazil[J].BMC Gastroenterol, 2012, 12: 49.

[10]Foley S L,Horne S M,Giddings C W,et al.Iss from a virulent avianEscherichiacoli[J].Avian Dis, 2000, 44(1): 185-191.

[11]Gao Q,Jia X,Wang X,et al.The avian pathogenicEscherichiacoliO2 strain E058 carrying the defined aerobactin-defective iucD or iucDiutA mutation is less virulent in the chicken[J].Infect Genet Evol,2015,30: 267-277.

[12]Wu H H,Yang Y Y,Hsieh W S,et al.OmpA is the critical component forEscherichiacoliinvasion-induced astrocyte activation[J].J Neuropathol Exp Neurol,2009,68(6): 677-690.

[13]崔艷艷，高洪，嚴(yán)玉霖，等．大腸埃希菌外膜蛋白F與細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展[J]．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(6)：164-166.

[14]魏寬翠，夏玉龍，馬興樹．禽致病性大腸埃希菌黏附素研究進(jìn)展動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展[J]．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(3)：105-109.

[15]樊琛，劉桂芹，王亞君，等．ss蛋白在雞源大腸桿菌不同毒力菌株中的檢測[J]．畜牧與獸醫(yī)，2010，42(2)：71-74.

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of PathogenicEscherichiacolifromElaphurusdavidianusin Shishou

GUO Ding-zong1,ZOU Miao1,WAN Chun-yun1,ZHANG Wei1,GUO Rui2, YANG Shi-jin1

(1.HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China;2.HubeiAcademyofAgriculturalScience,Wuhan,Hubei,430064,China)

Abstract:National Nature Reserve of Elaphurus davidianus in Shishou is one of the three protection bases in our country,and Elaphurus davidianus in the natural pasture are susceptible to E.coli,which may lead to death.In order to ascertain the current status of E.coli infection and epidemic and find out its pathogenicity and major virulence factors in Elaphurus davidianus in Shishou,we isolated 15 strains of pathogenic E.coli from the samples by the drug sensitivity tests，the biochemical identifications,16 S rDNA PCR and the virulence experiments in mice.The rusult of the drug sensitivity tests showed that 15 strains of E.coli were most susceptible to gentamicin,kanamycin and cefazolin and the sensitivity rate were 100%;and they were all susceptible to chloramphenicol,neomycin and streptomycin,and the sensitivity rate were more than 60%;they had a strong drug resistance to clindamycin and sulfadiazine,and the resistant rates were 80% and 60% respectively. The virulence detection results showed that the main virulence factors were ompA(100%),traTa(80%),ISS(80%),iucD(60%),irp2(53.33%),sta(33.33%),cva/cvi(26.67%) and VAT(20%).

Key words:pathogenic Escherichia coli;Elaphurus davidianus;isolation and identification;drug sensitivity test;virulence factor

文章編號:1007-5038(2016)03-0052-07

中圖分類號:S852.612;S858.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：郭定宗(1963-)，男，湖北人，教授，碩士，主要從事動物營養(yǎng)代謝病學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：鄂環(huán)辦(2011)282項(xiàng)目；長江航道整治生態(tài)補(bǔ)償項(xiàng)目

收稿日期：2015-06-10