高曉華，肖　雨，張明輝，安　偉，邵　玲，何正侃

(上海市水產(chǎn)研究所/上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站,上海 200433)

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熒光假單胞菌疫苗對(duì)異育銀鯽的免疫保護(hù)效應(yīng)

高曉華，肖雨，張明輝，安偉，邵玲，何正侃

(上海市水產(chǎn)研究所/上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站,上海 200433)

摘要：為探討熒光假單胞菌疫苗對(duì)異育銀鯽的免疫保護(hù)作用，為其在赤皮病防治上的應(yīng)用提供理論依據(jù),以福爾馬林滅活的熒光假單胞菌(Pseudamonas fluoroscens)全菌疫苗、菌體外膜蛋白(OMP)疫苗作為免疫原，以平均體重100.0 g±15.0 g的健康異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)為試驗(yàn)對(duì)象，通過腹腔注射免疫原(濃度分別為1.0 ×108/mL、0.2 mg/mL)免疫,劑量為 0.2 mL/尾,對(duì)照組注射等量滅菌生理鹽水。分別在免疫注射1、2、4、7、14、21、28、35 d后對(duì)試驗(yàn)魚尾靜脈采血，進(jìn)行外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、吞噬活性和抗體效價(jià)的測(cè)定。結(jié)果2種免疫原均可誘導(dǎo)異育銀鯽外周血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量增加, 吞噬細(xì)胞的吞噬活性和血清抗體效價(jià)均升高。免疫注射35 d后活菌攻毒，福爾馬林滅活熒光假單胞菌苗(F-PF)組的免疫保護(hù)率為61.1%，OMP組的免疫保護(hù)率為72.2%，OMP組的免疫保護(hù)效果優(yōu)于F-PF組。證明2種免疫原均通過促進(jìn)異育銀鯽血細(xì)胞增殖，產(chǎn)生特異性抗體的方式提高機(jī)體的免疫保護(hù)力。

關(guān)鍵詞：異育銀鯽；熒光假單胞菌；外膜蛋白；凝集抗體效價(jià)；免疫保護(hù)

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是我國主要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一，因其生長速度快、肉質(zhì)鮮美，深受養(yǎng)殖者的青睞[1]。近年來，隨著水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖水環(huán)境不斷惡化，異育銀鯽病害問題不斷增多，嚴(yán)重制約了異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2-3]。在異育銀鯽的細(xì)菌性疾病治療過程中，以抗生素等抗菌藥物為主要治療方式，由于病原菌耐藥性等多種原因，往往治療效果不佳[4]。赤皮病是由熒光假單胞菌引起的魚類細(xì)菌性疾病，該病常發(fā)生在越冬，捕撈、放養(yǎng)過程中魚體表面受到損傷后，赤皮病常與水霉病同時(shí)發(fā)生，藥物治療難以達(dá)到治愈效果，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較大危害，因此赤皮病的防控重點(diǎn)在于預(yù)防[5]。免疫接種被認(rèn)為是預(yù)防魚類細(xì)菌性疾病的有效途徑，能夠提高魚類的抗病性，減少疾病的發(fā)生，日益引起研究者的重視[6-7]。學(xué)者開展了嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)滅活菌苗以及菌體成分亞單位疫苗對(duì)異育銀鯽免疫應(yīng)答研究[8-9]，但從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來看,關(guān)于熒光假單胞菌(Pseudamonasfluoroscens)滅活全菌苗以及菌體成分亞單位疫苗針對(duì)異育銀鯽的免疫保護(hù)作用研究鮮有報(bào)道。本研究以福爾馬林滅活的熒光假單胞菌(Pseudamonasfluoroscens)全菌苗、菌體外膜蛋白(OMP)作為免疫原，采用腹腔注射的方式，對(duì)健康異育銀鯽進(jìn)行了免疫注射，測(cè)定免疫35 d內(nèi)各個(gè)免疫組異育銀鯽外周血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量、抗體效價(jià)的變化和相對(duì)免疫保護(hù)率，旨在為全菌疫苗以及菌體成分疫苗在魚病防控中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

異育銀鯽平均體重100.0 g±15.0 g ，平均體長15.0 cm±2.0 cm，無病無傷，在水族缸內(nèi)暫養(yǎng)1個(gè)月，水溫控制在28℃±1℃，并適量投喂飼料，上海市水產(chǎn)研究所奉賢試驗(yàn)基地惠贈(zèng)；用于試驗(yàn)的熒光假單胞菌和金黃色葡萄球菌菌種由上海市水產(chǎn)研究所病害防治實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。

1.2方法

1.2.1免疫原制備在無菌的條件下，將熒光假單胞菌菌株接種到TSB培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，離心收集菌體并以滅菌生理鹽水洗3次，向熒光假單胞菌菌懸液中加入終濃度為3.0 mL/ L的福爾馬林，恒溫水浴鍋28 ℃ 滅活48 h，即成福爾馬林滅活的熒光假單胞菌全菌苗(formalin killedPseudamonasfluoroscenscell，F(xiàn)-PF)，檢查細(xì)菌滅活效果后，稀釋至1.0×108CFU/mL，即為F- PF 免疫原；參照Dilip K S等[10]的Sarkosyl法(十二烷基肌酸鈉)從滅活的熒光假單胞菌全菌苗中提取外膜蛋白(OMP),滅菌生理鹽水重懸，參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(鼎國公司)方法，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整質(zhì)量濃度至0.2 mg/mL，即為OMP免疫原，將制備好的2種免疫原置-20 ℃冰箱備用。

在無菌的條件下，將黃金色葡萄球菌菌株接種到FWA培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，同F(xiàn)-PF制備方法，制成金黃色葡萄球菌吞噬原(formalin killedStaphylococcusaureuscells，F(xiàn)-SA),置4℃冰箱備用。

1.2.2安全性試驗(yàn)60尾試驗(yàn)魚隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組20尾。2個(gè)試驗(yàn)組分別注射F-PF、OMP免疫原，每尾0.2 mL，對(duì)照組注射等量的滅菌生理鹽水,觀察7 d。

1.2.3免疫接種與采血210尾試驗(yàn)魚隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組70尾。2個(gè)試驗(yàn)組分別注射F-PF、OMP免疫原，每尾0.2 mL，對(duì)照組注射等量的滅菌生理鹽水。注射免疫原1、2、4、7、14、21、28、35 d后，分別隨機(jī)從每組中各取5尾試驗(yàn)魚，尾靜脈采血，血液不混合。其中2尾血液抗凝，用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)；另外3尾血液不抗凝，室溫靜置1 h，4℃ 冰箱靜置24 h，3 000 r/min離心5 min取上層血清，用于抗體效價(jià)的檢測(cè)。

1.2.4血細(xì)胞計(jì)數(shù)參照Blaxhall P C等[11]方法，利用 Dacie稀釋液將血液稀釋400倍， Neubarer計(jì)數(shù)板完成紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)和白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.5吞噬細(xì)胞吞噬活性測(cè)定0.2 mL 抗凝血中加入0.05 mL F-SA,充分混勻后，置25℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，每10 min搖勻1次；3 000 r/min離心10 min；吸取白細(xì)胞層制涂片3張。Wright-Giemsa 染色液混合染色，油鏡下觀察。吞噬活性以吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指數(shù)(phagocytic index，PI)表示，并按下公式計(jì)算：

吞噬百分比(PP)=(100個(gè)白細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100) × 100%

吞噬指數(shù)(PI)=(100個(gè)吞噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌總數(shù)/100)×100%

1.2.6血清抗體效價(jià)檢測(cè)采用96孔血凝板法進(jìn)行，取0.2 mL血清于96孔板中，用生理鹽水按對(duì)倍稀釋法稀釋，加入等體積反應(yīng)抗原F- PF，置恒溫水浴鍋37℃孵育24 h，取出后室溫靜置15 min，顯微鏡下觀察凝集反應(yīng)的強(qiáng)度。

1.2.7免疫器官指數(shù)測(cè)定試驗(yàn)異育銀鯽免疫注射后35 d，2個(gè)免疫組和對(duì)照組每組隨機(jī)選取3尾，分別取頭腎和脾臟用濾紙吸干表面的水分后稱重，并計(jì)算免疫器官指數(shù)。頭腎指數(shù)=頭腎質(zhì)量(g)/體重(kg)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(g)/體重(kg)。

1.2.8免疫保護(hù)試驗(yàn)免疫注射后35 d，從每個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組中各取20尾魚，免疫組分別通過腹腔每尾注射1.0×108CFU/mL熒光假單胞菌活菌，對(duì)照組注射等量的滅菌生理鹽水，觀察14 d，記錄感染發(fā)病和死亡情況，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率(relative percent survival，RPS)。相對(duì)免疫保護(hù)率=(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)× 100%[12]。

1.2.9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析。以t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P>0.05不存在顯著性差異；P<0.05存在顯著性差異，P<0.01存在極顯著性差異。

2結(jié)果

2.1安全性試驗(yàn)

注射F-PF、OMP免疫原及滅菌生理鹽水的健康異育銀鯽飼養(yǎng)7 d后，無菌的條件下，對(duì)試驗(yàn)異育銀鯽進(jìn)行剖檢，從各器官及腹腔進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。結(jié)果異育銀鯽生長狀態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象或染病癥狀，試驗(yàn)異育銀鯽體內(nèi)未分離出熒光假單胞菌。表明用于本試驗(yàn)的免疫原及其劑量對(duì)異育銀鯽是安全的。

2.2血細(xì)胞計(jì)數(shù)

注射F-PF、OMP 2種免疫原后，F(xiàn)-PF組、OMP組異育銀鯽外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1所示。從圖1A可見免疫注釋后，F(xiàn)-FP組和OMP組血液中紅細(xì)胞的數(shù)目不斷增加，到第4、7、14天，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他時(shí)間無顯著差異(P>0.05)。從圖1B可見，從免疫注釋后的第1天開始，對(duì)照組白細(xì)胞一直在4.32×107/mL上下浮動(dòng)，F(xiàn)-FP組和OMP組血液中白細(xì)胞的數(shù)目迅速增長，免疫注射后第4、7、14天免疫組白細(xì)胞均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，免疫注射后第2、21、28天，免疫組白細(xì)胞顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。免疫注射后第4天，白細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到最大值，隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，至免疫35 d后2個(gè)免疫組白細(xì)胞的數(shù)目仍比對(duì)照組略高。

2.3吞噬細(xì)胞吞噬活性測(cè)定結(jié)果

注射F-PF、OMP 2種免疫原后，F(xiàn)-PF組、OMP組異育銀鯽外周血吞噬細(xì)胞的PP、PI變化如圖2所示，2個(gè)免疫組PP、PI呈上升趨勢(shì)，免疫注射后第4天均達(dá)到峰值，F(xiàn)-PF組、OMP組的PP、PI值分別為28.67%、33.12%和3.69、4.02，隨后呈下降趨勢(shì)。2個(gè)免疫組在免疫注射后第4天其PP值均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，第7、14、21天顯著高于對(duì)照組(0.010.05)(圖2A)；在第4、7天其PI值極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，第14、21天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他時(shí)間無顯著差異(P>0.05)(圖2B)。在體外觀察發(fā)現(xiàn)鯽魚的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬了許多金黃色葡萄球菌，還在混有紅細(xì)胞的涂片中發(fā)現(xiàn)許多紅細(xì)胞內(nèi)有金黃色葡萄球菌等現(xiàn)象。

A.紅細(xì)胞數(shù)量;B.白細(xì)胞數(shù)量

A.Number of erythrocytes;B.Number of leucocytes

圖1免疫組和對(duì)照組異育銀鯽外周血血細(xì)胞數(shù)量變化

Fig.1The variation of hematocyte numbers in peripheral blood ofCarassiusauratusgibelioin immunized group sand control group

A.吞噬百分比;B.吞噬指數(shù)

A.Phagocytic percentage;B.Phagocytic index

圖2免疫組和對(duì)照組異育銀鯽外周血吞噬細(xì)胞吞噬活性變化

Fig.2The variation of phagocytic activities of phagocytes in peripheral blood ofCarassiusauratusgibelioin immunized groups and control group

2.4血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)2種免疫原分別免疫注射后，各免疫組異育銀鯽血清抗體效價(jià)均出現(xiàn)升高(表1)。免疫2 d后，各免疫組的血清均出現(xiàn)少量抗體(效價(jià)小于20.0)。隨著免疫時(shí)間的延長，血清抗體效價(jià)不斷升高，OMP組在免疫注射后第21天抗體效價(jià)達(dá)到峰值為1∶170.67，F(xiàn)-PF組在免疫注射后第28天抗體效價(jià)達(dá)到峰值為1∶298.67。2個(gè)免疫組抗體效價(jià)達(dá)到峰值后，抗體效價(jià)均逐漸下降。對(duì)照組血清抗體效價(jià)，穩(wěn)定在1∶4.00～1∶5.33左右。

免疫注射后第28 、35天，免疫組抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照組抗體效價(jià)(P<0.05)，其他時(shí)間無顯著差異(P>0.05)。F-PF免疫組抗體效價(jià)始終高于OMP免疫組，由此可見，F(xiàn)-PF、OMP 2種免疫原均能明顯提高異育銀鯽的抗體水平。

表1　免疫組和對(duì)照組異育銀鯽血清中凝集抗體效價(jià)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The values with different small letters mean significant difference(P<0.05).

2.5免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)魚免疫注射35 d后，從表2可以看出,頭腎指數(shù) F-PF組顯著高于OMP組(P<0.05)，OMP組的頭腎指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；2個(gè)免疫組的脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，由此可見，F(xiàn)-PF、OMP 2種免疫原均能促進(jìn)異育銀鯽的免疫器官發(fā)育。

表2　免疫組和對(duì)照組異育銀鯽免疫器官指數(shù)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The values with different small letters mean significant difference(P<0.05).

2.6相對(duì)免疫保護(hù)率

攻毒14 d后，2個(gè)免疫組異育銀鯽均表現(xiàn)出明顯的相對(duì)保護(hù)率，F(xiàn)-PF組相對(duì)免疫保護(hù)率為61.1%，OMP組相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)72.2%(表3)。對(duì)攻毒感染試驗(yàn)死亡魚進(jìn)行解剖檢查，分離培養(yǎng)細(xì)菌并進(jìn)行鑒定，證實(shí)試驗(yàn)魚的死因?yàn)槿斯じ腥驹摬【滤馈?/p>

表3　活菌攻毒后異育銀的死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率

3討論

有關(guān)疫苗對(duì)于異育銀鯽的免疫保護(hù)作用，已有許多研究者做過相關(guān)研究。毛會(huì)麗等[13]將嗜水氣單胞菌滅活疫苗以注射的方式免疫接種異育銀鯽，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)異育銀鯽的細(xì)菌性出血病具有顯著的保護(hù)作用，其相對(duì)免疫保護(hù)率高達(dá)90%。范鵬飛等[14]研究發(fā)現(xiàn)，滅活疫苗能夠引起異育銀鯽體內(nèi)血液指標(biāo)的變化，激活魚體免疫系統(tǒng)，有效增強(qiáng)魚體對(duì)致病菌的免疫抵抗力。黃新新等[15]用遲緩愛德華全菌苗及菌體外膜蛋白(OMP)免疫銀鯽后，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白(OMP)組免疫保護(hù)率顯著高于全菌組的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，將異育銀鯽赤皮病致病菌熒光假單胞菌株制備成福爾馬林滅活菌苗，以及菌體外膜蛋白(OMP)疫苗，2種免疫原分別免疫異育銀鯽，免疫注射35 d后，活菌攻毒觀察14 d后，F(xiàn)-PF組的相對(duì)免疫保護(hù)率為61.1%，OMP組的相對(duì)免疫保護(hù)率為72.2%，2種免疫原均顯著提高免疫魚的免疫保護(hù)能力，菌體外膜蛋白(OMP)疫苗的免疫保護(hù)效果更好。

當(dāng)外源物質(zhì)進(jìn)入魚體以后，免疫系統(tǒng)被激活，早期的非特異性免疫通過魚體的外周血細(xì)胞迅速的增加方式，對(duì)外源物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。張振東等[16]研究表明，牙鲆的紅細(xì)胞具有免疫功能，參與牙鲆的非特異性免疫，Kollne B等[17]研究發(fā)現(xiàn),注射全菌疫苗能刺激虹鱒產(chǎn)生免疫應(yīng)答，引起血液中白細(xì)胞數(shù)量顯著增加。菌體外膜蛋白(OMP)富含β折疊的結(jié)構(gòu)能夠直接激活巨噬細(xì)胞，刺激白細(xì)胞的迅速增殖[18]。本試驗(yàn)中異育銀鯽經(jīng)F-PF、OMP 2種免疫原分別免疫注射之后第2 天開始其外周紅白細(xì)胞數(shù)量明顯增加，這與羅芬等[19]研究發(fā)現(xiàn)注射滅活溫和氣單胞菌疫苗后中華倒刺鲃外周紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量增加現(xiàn)象相似，此外在混有紅細(xì)胞的涂片中發(fā)現(xiàn)許多紅細(xì)胞有吞噬金黃色葡萄球菌的現(xiàn)象，表明與紅細(xì)胞與白細(xì)胞具有免疫功能，參與免疫清除外源物質(zhì)的作用相關(guān)。

魚類的頭腎在腎臟發(fā)育的過程中失去了排泄功能，成為了免疫器官；脾臟是魚類紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生、貯存和成熟的主要場(chǎng)所，具有造血和免疫功能。本試驗(yàn)中異育銀鯽經(jīng)F-PF、OMP 2種免疫原免疫注射35 d后，其頭腎指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，與董少杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)滅活菌苗能夠增強(qiáng)錦鯉頭腎和脾臟的發(fā)育現(xiàn)象相吻合，表明2種免疫原均對(duì)異育銀鯽免疫器官的發(fā)育具有促進(jìn)作用。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異育銀鯽經(jīng)2種免疫原分別免疫后，各免疫組抗體效價(jià)緩慢上升，OMP組抗體效價(jià)第21天達(dá)到峰值1∶170.67，之后緩慢下降；F-PF組抗體效價(jià)達(dá)到峰值的時(shí)間滯后于OMP組，第28天達(dá)到峰值1∶298.77。 F-PF組的抗體效價(jià)高于OMP組，但OMP組的相對(duì)免疫保護(hù)率高出F-PF組11.1%，這種現(xiàn)象與耿曉修等[21]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果相似，血清抗體效價(jià)水平與疫苗免疫保護(hù)效應(yīng)并不完全一致；本試驗(yàn)中抗體效價(jià)3個(gè)組平行數(shù)據(jù)存在差異現(xiàn)象，與人工采血過程中操作誤差有直接的關(guān)系，因此在采血過程中應(yīng)盡量減小人工操作誤差，以確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。此外，本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步佐證了接種細(xì)菌疫苗能夠增強(qiáng)魚體的免疫力，為細(xì)菌疫苗在異育銀鯽赤皮病防治上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1]李怡，曹海鵬，楊先樂，等.異育銀鯽氣單胞菌病的初步研究[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2007，4(1)：40-43.

[2]陸文浩，楊家新，陳輝，等.異育銀鯽類志賀鄰單胞菌的鑒定[J].淡水漁業(yè)，2009，39(2)：48-53.

[3]夏飛，梁利國，謝駿.異育銀鯽病原維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].淡水漁業(yè)，2012，42(5)：22-26.

[4]王美珍，陳昌福，劉振興，等.嗜水氣單胞菌對(duì)四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30(1)：89-93.

[5]鄭萬明，廖廣成.水霉病和赤皮病的發(fā)病原因及防治措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2010，4(5)：190-190.

[6]楊先樂.魚用疫苗的現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢(shì)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1996，20(2)：89-93.

[7]Sommerset I， Krossoy B，Biering E， et al.Vaccines for fish in aquaculture[J].Expert Rev Vac， 2005，4(1)：89 -101.

[8]張秋勝，陳昌福.異育銀鯽對(duì)嗜水氣單胞菌滅活菌苗的免疫應(yīng)答[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20(3)：271-274.

[9]陳昌福，陳超然.魚類三種致病菌的粗脂多糖對(duì)異育銀鯽的免疫原性[J].水生生物學(xué)報(bào)，2002，26(5)：483-488.

[10]Dilip K S,Tapas K S,Asoke C G.Major outer membrance proteins ofVibriocholeraeand the role in induction of protective immunity through inhibition of intestinal colonization[J].Infect Immun，1992， 60(11)：4848-4855.

[11]Blaxhall P C，Daisley K W.Routine haematological methods for use with fish blood [J].J Fish Biol，1973，5(6)：771-781.

[12]宵彗，李軍，王祥紅，等.鱸魚鰻弧菌病疫苗的制備[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，32(2)：226-232.

[13]毛會(huì)麗，關(guān)建義，賀文旭，等.嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽的免疫效果研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，11(30)：1499-1507.

[14]范騰飛，葉應(yīng)旺，胡王，等.滅活疫苗對(duì)異育銀鯽敗血癥血液和生化指標(biāo)的影響研究[J].淡水漁業(yè)，2013，43(4)：64-68.

[15]黃新新, 陸承平.遲緩愛德華菌全菌及外膜蛋白的免疫力比較[J].免疫學(xué)雜志，2002，18(3)：187-189.

[16]張振冬，張培軍，莫照蘭.牙鲆紅細(xì)胞免疫功能的初步研究[J].高技術(shù)通訊，2006，16(12)：1312-1315.

[17]Kollner B, Kotterba G.Temperature dependent ativation of leucocyte populations of rainbow trout，Oncorhynchusmykiss，after intraperitoneal immunization withAeromonassalmonicida[J].Fish Shellfish Immunol，2002，12(1)：35 -48.

[18]Francis C H， Ellis A E. Production of a lymphokine(macrophage activating factor) by salmon (Salmosalar) leucocytes stimulated with outer membrane protein antigens ofAeromonassalmonicida[J].Fish Shellfish Immunol，1994，21(4)：4894-4897.

[19]羅芬，張其中，馮漢茹，等.滅活菌苗免疫的中華倒刺鲃外周血免疫指標(biāo)的變化[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34(4)：626 -634.

[20]董少杰，梁擁軍，孫向軍，等.口服免疫滅活菌苗對(duì)錦鯉幼魚非特異性免疫功能的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25(5)：223-227.

[21]耿曉修，詩華，孫翰昌，等.熒光假單胞菌滅活疫苗對(duì)草魚的免疫保護(hù)效應(yīng)[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，28(1)：120-123.

Immune Protection Effects ofPseudamonasfluoroscensVaccens onCarassiusauratusgibelio

GAO Xiao-hua,XIAO Yu,ZHANG Ming-hui,AN Wei,SHAO Ling,HE Zheng-kan

(ShanghaiFisheriesResearchInstitute,ShanghaiFisheriesTechnicalExtensionStation,Shanghai,200433,China)

Abstract:To investigate the immune protection effects of Pseudamonas fluoroscens vaccens on Carassius auratus gibelio and provide important scientific basis on prevention and treatment of red skin disease.Formalin-killed Pseudamonas fluoroscens cells (F-PF) and outer membrane protein(OMP) were used as immunogen to immunize healthy Carassius auratus gibelio with an average body weight of 100.0 g±15.0 g.Each individual was intraperitoneally injected with 0.2 mL 1.0×108 mL formalin-killed Pseudamonas fluoroscens in F-PF group and 0.2 mL 0.2 mg/mL outer membrane protein in OMP group,and with 0.2 mL 6.5 mg/ mL sterile saline in control group,respectively.Then,approximate 2 mL of blood was taken from each fish caudal vein on day 1,2,4,7,14,21,28 and 35 post injection to study the changes of immune parameters,such as haematocyte number,phagocytic activity of phagocytes,serum antibody titer.The results showed that increasing number of erythrocytes and leucocytes in peripheral blood and phagocytic activity of phagocytes of immunized Carassius auratus gibelio were made by two vaccines;The result of challenge with live Pseudamonas fluoroscens showed that Carassius auratus gibelio immunized with two vaccines had good relative percent survival(RPS).OMP group had the higher RPS,which was 72.2%.F-PF group had the RPS with 61.1%.All the results stated above suggested that two vaccines could enhance the immunity of Carassius auratus gibelio,such as haematocyte number,serum antibody titer,against bacterial pathogen infection.

Key words:Carassius auratus gibelio；Pseudamonas fluoroscens；outer membrane protein(OMP)；agglutinating antibody titer；protective effect

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0042-05

中圖分類號(hào):S852.43

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡介：高曉華(1986- )，女，河南開封人，助理工程師，碩士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治技術(shù)研究。

基金項(xiàng)目：上海市農(nóng)委青年成長計(jì)劃項(xiàng)目(滬農(nóng)青字( 2015 )第 3-7 號(hào))

收稿日期：2015-04-15