馬光強，劉麗娟，文　明,2，王開功,2，程振濤,2*，周碧君,2*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州貴陽 550025)

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山羊源產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的分離與鑒定

馬光強1，劉麗娟1，文明1,2，王開功1,2，程振濤1,2*，周碧君1,2*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州貴陽 550025)

摘要：從貴州省盤縣某養(yǎng)羊場病例組織樣本中分離出1株疑似產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Lm)。通過革蘭染色、生化鑒定、PCR擴增hly基因、克隆、測序、序列分析及藥敏試驗等方法對可疑菌株進行分析鑒定。結(jié)果顯示,該分離菌的培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)、菌體形狀特征、生理生化特征均與文獻報道的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌相同，并從該分離菌株基因組中擴增到大小約850 bp的Lm的特異性DNA片段，其序列與GenBank中其他Lm地方株核苷酸同源性在39.1%～99.7%之間，其中與從發(fā)病動物分離到的加拿大、瑞士參考株同源性最高，均達到99.7%，與其他途徑分離到的參考菌株同源性都很低，分子水平上進一步證實分離菌株為產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌，且從不同途徑分離的地方株hly基因差異大。研究結(jié)果為本病臨床防控與治療提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌；分離鑒定；hly基因；序列分析；山羊

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陽性桿菌，可穿越宿主的腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障，也是一種重要的食源性人獸共患病原菌[1-2]。機體主要靠細(xì)胞免疫功能清除本菌[3]。Lm在自然界中分布廣泛，營腐生生活，能在0℃～45℃、pp.4～9.4的環(huán)境中生長，可以從腐敗植物、水、土壤、糞便中分離到Lm[4]，尤其是屠宰場和食品加工廠周圍的環(huán)境，很容易被帶菌糞便污染[5-6]。Lm引起的動物李斯特菌病以散發(fā)性或小范圍暴發(fā)為主，可引起豬、綿羊、牛、家兔發(fā)生腦膜腦炎、流產(chǎn)和急性敗血病，家禽感染可導(dǎo)致敗血癥和心肌壞死[7-8]。Lm也是李斯特菌屬唯一感染人類的細(xì)菌[9]，除了對畜牧業(yè)造成經(jīng)濟損失以外，還可通過動物性食品傳染給人，對人類健康造成極大威脅[10]。

Lm的致病性大多與其毒力基因息息相關(guān)。賀春月等[11]2013年對我國14個省383株Lm的研究，得出hly基因是Lm中55個致病相關(guān)基因之一，并且存在于所有供試菌株中。隨著遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，已有很多證據(jù)證明hly是李斯特菌屬中Lm特有的毒力標(biāo)志基因，它編碼的李斯特菌溶血素LLO是Lm重要且必須的毒力因子之一，不存在于其他非致病性李斯特菌中。基于其所建立的PCR檢測方法可區(qū)分Lm和其他非致病性的李斯特菌[12]。

2015年1月，貴州省六盤水市盤縣某羊場存欄波爾山羊1 000余只，其中有34只年齡2歲～4歲的羊只陸續(xù)表現(xiàn)出呼吸急促，食欲下降，機體消瘦，流涎，口吐白沫等癥狀，死亡19只，發(fā)病率3.4%,病死率55.88%。對該羊場2頭發(fā)病羊的剖檢可見肺充血、水腫，腸系膜淋巴結(jié)腫大，肝臟有灰白色壞死灶，脾臟腫大等病理變化。對2只羊的肝臟、脾臟、腎臟和腦組織進行細(xì)菌分離，對分離病原進行生化、分子生物學(xué)鑒定及耐藥性分析，對臨床病例做出確診。對單增李斯特菌hly基因進行克隆測序，分析其與國內(nèi)外分離菌株的基因同源性與親緣關(guān)系，為貴州省羊場產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌病的防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種及樣本來源單增李斯特菌參考株GZ-CK，由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室分離并保存；病羊，來自貴州省盤縣某羊場。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；克隆載體pMD19-T由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存；2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000 、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit(50×)、EZNATMPlasmid Mini Kit質(zhì)粒提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；其他它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3引物參照文獻[13]合成Lm hly基因特異性引物，序列為:hly-P1:5'-CCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAA-3'，hly-P2:5'-TAGTTCTACATCAACTGAGACAGA-3'，預(yù)擴增片段大小約850 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離培養(yǎng)取病羊的肝臟、脾臟、腎臟和腦等病變組織在無菌條件下接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，每一病料接種兩個平板，于37℃條件下分別進行需氧及厭氧培養(yǎng)24 h，然后在無菌條件下分別挑取血平板上的單個菌落，普通培養(yǎng)基(加血清)進行擴大純培養(yǎng)和革蘭染色鏡檢。

1.2.2生化鑒定將分離菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)20 h，接種生化反應(yīng)管，于37℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄結(jié)果，參考對照表判定反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3藥敏試驗將分離株和參考株(GZ-CK)菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞舛龋脽o菌棉拭子蘸取菌懸液，在試管壁上擠壓去掉多余菌液后均勻涂布于厚約4 mm的血瓊脂平板，將藥敏紙片均勻置于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。根據(jù)NCCLS抗微生物藥物敏感試驗的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(紙片擴散法)判斷結(jié)果。

1.2.4病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1基因組總DNA提取將分離株和參考株純化培養(yǎng)后。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.4.2Lm-hly基因PCR擴增以所提取的基因組總DNA為模板，應(yīng)用引物hly-P1/ hly-P2進行目的基因擴增。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)，加滅菌雙蒸水補足至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃40 s，57 ℃40 s，72 ℃90 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4.3Lm hly基因克隆及序列分析hly基因PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，參照Gel Extraction Kit小量膠回收試劑盒操作說明書進行目的基因膠回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Dpα。按照EZNATMPlasmid Mini Kit試劑盒提取重組菌質(zhì)粒DNA進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。用DNA MAN等生物軟件將Lm貴州分離株hly基因測序序列與國內(nèi)外分離株進行同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2結(jié)果

2.1病原形態(tài)及培養(yǎng)特性

組織材料接種普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基37℃ 24 h，可見分離細(xì)菌在有氧和無氧條件下均生長，普通營養(yǎng)瓊脂上生長稀疏，麥康凱瓊脂上不生長，血瓊脂平板上生長茂盛，呈中等大小、圓形、濕潤、表面光滑、邊緣整齊、灰白色、露滴樣菌落，菌落周圍產(chǎn)生β溶血環(huán)(圖1、圖2)，與參考株及文獻報道Lm的培養(yǎng)特性一致。革蘭染色鏡檢顯示，分離細(xì)菌為革蘭陽性、無芽胞、無莢膜、兩端鈍圓、兩極著色的短桿菌(圖3、圖4)，分離細(xì)菌形態(tài)與文獻報道一致。

圖1　分離菌在血平板上的生長情況

圖2　參考菌在血平板上的生長情況

2.2生化鑒定結(jié)果

分離菌和Lm參考株分別接種于相應(yīng)生化反應(yīng)管，37℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果見表1。由表1統(tǒng)計結(jié)果可知，分離菌株與Lm參考菌株的生化鑒定結(jié)果相同，且符合單增李斯特菌的生化特性，初步將其命名為Lm-GZPX01。

2.3藥敏試驗結(jié)果

選擇5類21種抗菌藥物進行Lm-GZPX01的藥敏試驗，結(jié)果見表2。分離株對β-內(nèi)酰胺類藥物廣泛耐藥，對氨基糖苷類藥物較為敏感，對大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類藥物最敏感。

圖3　分離菌革蘭染色顯微鏡下觀察結(jié)果(1 000×)

圖4　參考菌革蘭染色顯微鏡下觀察結(jié)果(1 000×)

生理生化特征Physiologicalandbiochemicalcharacteristics分離菌Isolatedstrain參考菌Referencestrain過氧化氫Hydrogendioxide++葡萄糖Glucose++乳糖Lactose++果糖Fructose++海藻糖Mycose++麥芽糖Maltose++鼠李糖Rhamnose++山梨醇Sorbitol++七葉苷Esculoside++木糖Xylose--甘露醇Mannitol--棉子糖Melitose--衛(wèi)矛醇Dulcitol--甲基紅MethylRed(M-R)++乙酰甲基甲醇Voges-Proskauer(V-P)++硝酸鹽Nitrate--

注：“+”陽性反應(yīng)；“-”陰性反應(yīng)。

Notes："+"Positive；"-"Negative．

表2　分離菌藥敏試驗結(jié)果

注：E.極度敏感；S.高度敏感；I.中度敏感；R.耐藥。

Note:E. Extreme sensitivity；S.High sensitivity; I.Intermediate sensitivity;R.Resistance.

2.4Lm-GZPX01和Lm GZ-CK PCR檢測結(jié)果

以Lm-GZPX01和Lm GZ-CK基因組DNA為模板，采用特異性引物hly-P1/hly-P2進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖5。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.Lm-GZPX01；2.Lm GZ-CK；3.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1.Lm-GZPX01；2.Lm GZ-CK；3.Negative control

圖5PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

Fig.5Electrophoresis of PCR products

從圖5可知， Lm-GZPX01和Lm GZ-CK基因組DNA模板均能擴增出大小約為850 bp的特異性片段，與預(yù)期擴增片段大小相符，初步說明分離細(xì)菌基因組含有hly基因序列，要確定是否是hly基因特異性片段尚需進行測序判斷。

2.5目的基因克隆測序及序列分析結(jié)果

2.5.1重組質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定采用引物hly-1/hly-2對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BamH I和SalI對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖6。

由圖6可見，重組質(zhì)粒PCR擴增可見一條大小約850 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致；雙酶切產(chǎn)物中可見載體條帶(2 692 bp)和目的條帶(約850 bp)，結(jié)果說明，成功構(gòu)建了含Lm分離株和參考株hly基因的重組質(zhì)粒。

2.5.2序列分析結(jié)果

2.5.2.1系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果應(yīng)用BLAST軟件將Lm-GZPX01 hly基因序列與 GenBank 中已發(fā)表部分Lm株 hly 基因序列進行系統(tǒng)進化樹分析 (圖7)。由圖7可見，Lm-GZPX01與加拿大(Lm 08-5578)和瑞士(Lm60)參考菌株親源關(guān)系最近，與實驗室參考菌株親緣關(guān)系較近，而與其他參考株親緣性相對較遠(yuǎn)。

2.5.2.2同源性分析結(jié)果應(yīng)用DNA Star分析

軟件對Lm-GZPX01和國內(nèi)外不同地方株到的hly基因序列進行核苷酸同源性分析(表3)，結(jié)果顯示，hly基因核苷酸同源性和與本實驗室參考菌株、加拿大株和瑞士株最高，均達到99.7%，而與其他參考株均較低，介于39.1%～39.4%之間。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.Lm-GZPX01重組質(zhì)粒；2.Lm GZ-CK重組質(zhì)粒；3.Lm-GZPX01重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；4.參考株重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；5.空質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 2 000；1.The recombinant plasmid of Lm-GZPX01；2.The recombinant plasmid of Lm GZ-CK；3.Double enzyme digestion products of Lm-GZPX01 recombinant plasmid；4.Double enzyme digestion products of Lm GZ-CK recombinant plasmid；5.Eempty plasmid

圖6重組質(zhì)粒PCR及酶切鑒定結(jié)果

Fig.6Identification results of recombinant plasmid by

PCR and enzyme digestion

圖7　基于hly基因核苷酸序列的遺傳進化樹

3討論

李氏桿菌病是由Lm引起的一種人獸共患病，其中羊最為敏感，該病在牛群中零星散發(fā)，其中多數(shù)病例與冬季飼喂質(zhì)量較差的、發(fā)酵的青貯飼料有關(guān)。牛、羊的發(fā)病年齡基本一致，一般為2歲～3歲[14]。Lm作為一種重要的病原菌，廣泛存在于自然界，由于Lm對各種惡劣環(huán)境條件有著較強的耐受性，使得其較易處于食物鏈的每一個環(huán)節(jié)而導(dǎo)致人和動物發(fā)病，使得各種食品受到污染，最終嚴(yán)重威脅人類的健康。本試驗通過實驗室細(xì)菌分離技術(shù)從貴州省盤縣某養(yǎng)羊場臨床病例獲得分離菌株，其形態(tài)特征、革蘭染色特性和生化特征均與Lm參考株相符；hly基因是Lm特有的基因，存在于所有Lm中，PCR鑒定結(jié)果證實其基因組中含有約850 bp的預(yù)期擴增hly基因核酸片段，基因測序結(jié)果證實，從貴州省某羊場病羊中分離的菌株確為單增李斯特菌。單增李斯特菌為規(guī)?；B(yǎng)羊場的主要病原菌之一[15-17]，也是一種危害嚴(yán)重的食源性人獸共患病原菌[18-19]，研究內(nèi)容為本病防控及食品安全提出預(yù)警預(yù)報。

表3　Lm-GZPX01株hly基因與參考毒株的hly基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸同源性分析結(jié)果

hly基因是Lm主要的毒力基因，本研究中對Lm貴州分離株hly基因進行系統(tǒng)進化、核苷酸同源性分析表明，Lm貴州分離株與本實驗室參考菌株、加拿大株和瑞士株進化關(guān)系近，而與其他參考菌株關(guān)系較遠(yuǎn)。比較菌株來源發(fā)現(xiàn)，與Lm貴州分離株hly基因序列同源性高的3株細(xì)菌均分離自發(fā)病動物，而其他菌株為屠宰場環(huán)境、加工廠食品、動物性食品及運輸工具等來源的分離菌。不同來源分離株與基因特征關(guān)系相關(guān)性因素尚不明確，但對病原感染防控和環(huán)境污染防控可能預(yù)示不同解決方案。本研究亦對Lm本地分離株進行藥物敏感試驗分析，結(jié)果顯示，分離菌對β-內(nèi)酰胺類藥物廣泛耐藥，對氨基糖苷類藥物較為敏感，對大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類藥物最敏感。這與尹錄等[20]2009年的Lm對β-內(nèi)酰胺類藥物敏感的研究結(jié)果不同，與王文燕[21]2014年的Lm對環(huán)丙沙星、氧氟沙星敏感的研究結(jié)果相似。由于李斯特菌容易產(chǎn)生耐藥性，故在進行該病的治療時應(yīng)避免長時間使用同一種或同一類抗菌藥物，以避免或減緩其強耐藥性菌株的出現(xiàn)。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌廣泛分布于自然界，主要經(jīng)食源性散播，污染飼草的來源和途徑，因此，預(yù)防該病原菌的感染要從嚴(yán)格把控飼料的生產(chǎn)、加工、儲存等途徑盡量減少污染。結(jié)合藥物敏感試驗，定期對山羊群體進行藥物防控，使用消毒藥物對養(yǎng)殖環(huán)境進行消毒是有效控制疫情的重要手段。

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Isolation and Identification of aListeriamonocytogenesStrain in Caprine

MA Guang-qiang1, LIU Li-juan1,WEN Ming1,2,WANG Kai-gong1,2,CHENG Zhen-tao1,2, ZHOU Bi-jun1,2

(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUiversity,Guiyang,Guizhou,550025,China;2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandVeterinaryPublicHealthinGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou,550025,China)

Abstract:A Listeria monocytogenes(Lm) was isolated from the tissue samples of a infected case in a caprine farm in Pan county of Guizhou province.The isolated strain was analysed and identified by means of Gram staining,biochemical identification,PCR amplification of hly gene,cloning,sequencing,sequence analysis and drug susceptibility test.The results showed that a suspected Lm was isolated from a suspected caprine case,and its cultural characteristics,colony morphology,and physiological-biochemical characteristics were the same as the Lm in literature reports.A specific DNA fragment about 850 bp of Lm was amplified.The nucleotide homology is between 39.1%-99.7% compared with part of strains in GenBank,and is the higest with the strains from Canada and Switzerland(99.7%),very low with the other strains isolated from other ways.The result from the molecular level confirmed that the isolate is a Lm,and the genetic differences between the hly genes of local strains isolated from different ways were significant.The results can provide theoretical data for prevention and treatment of the disease.

Key words:Listeria monocytogenes;isolation and identification;hly gene;sequence analysis;goat

文章編號:1007-5038(2016)03-0033-06

中圖分類號:S852.61

文獻標(biāo)識碼:A

作者簡介：馬光強(1987-)，男，貴州石阡人，碩士研究生，主要從事動物疫病細(xì)菌學(xué)研究。*通訊作者

基金項目：貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(黔科合NY[2014]3042號)

收稿日期：2015-08-26