張永武，連　海，張錦霞，張靜遠，劉　曄，張守峰，扈榮良

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130000)

?

表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建及鑒定

張永武，連海，張錦霞，張靜遠，劉曄，張守峰*，扈榮良*

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130000)

摘要：利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達了豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，并對該蛋白的生物活性進行鑒定。PCR獲得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ載體質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pFastBacⅠ-Cap轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選獲得重組桿粒rBacmid-Cap。以脂質(zhì)體法將重組桿粒轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒。電鏡下可見典型的桿狀病毒，SDS-PAGE顯示,重組病毒表達的Cap蛋白約28 ku，間接免疫熒光試驗證明,Cap蛋白良好表達并具有免疫反應(yīng)性,為豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；Cap蛋白；桿狀病毒表達系統(tǒng)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)的主要病原，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)、先天性震顫(Congenital tremors，CT)、豬皮炎和腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)以及豬繁殖障礙(Reproductive failure)等[1-2]。目前PCV-2感染已遍布全球，成為危害養(yǎng)殖業(yè)的重要病毒之一[3]。

PCV-2屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)，圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，病毒顆粒為20面體對稱，無囊膜，病毒粒子直徑17 nm，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的致病性動物病毒之一[4]。PCV-2基因組為單鏈閉合環(huán)狀DNA，全長1 767 bp或1 768 bp，毒株間核苷酸序列同源性大于96%。PCV-2含有ORF1和ORF2兩個主要開放閱讀框，其中ORF1編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)，ORF2編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)[5]。Cap蛋白為PCV-2的主要免疫原性蛋白，可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體，清除體內(nèi)病毒并使機體免受病毒損傷[5-6]。有研究表明，單獨的Cap蛋白可以自我組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)。PCV-2的VLPs不含病毒基因組，不能復(fù)制，但依然可以刺激機體產(chǎn)生抗體，大大提高了疫苗生產(chǎn)和使用的安全性[7-8]。因此，基于Cap蛋白的VLPs疫苗為PCV-2疫苗研究提供了新的途徑。

目前已有PCV-2滅活疫苗上市，但是由于PCV-2在細胞上病毒滴度低，生產(chǎn)周期長，給該病的控制帶來一定困難，因此研究新型疫苗成為人們努力的方向[9]。桿狀病毒表達系統(tǒng)為真核表達系統(tǒng)，可以對外源蛋白進行正確的轉(zhuǎn)錄后修飾，并且生物活性較好且安全性較高，成為較理想的蛋白表達系統(tǒng)[10]。因此，本研究通過桿狀病毒表達系統(tǒng)表達Cap蛋白，并對其生物活性進行鑒定，為PCV-2亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、細胞、菌種、病毒pMD18T-PCV-2-Cap質(zhì)粒、野生型桿狀病毒AcMNPV，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所流行病研究室構(gòu)建并保存；Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)(包括pFastBacTMⅠ質(zhì)粒，E.coliDH10BacTM，Sf9昆蟲細胞)，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ，T4 DNA連接酶，Q5 超保真DNA聚合酶，NEB公司產(chǎn)品；Cellfectin○RⅡ轉(zhuǎn)染試劑，Grace昆蟲培養(yǎng)基，Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司產(chǎn)品；鼠源抗PCV-2-Cap蛋白單克隆抗體，浙江大學(xué)周繼勇教授惠贈；FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1目的基因克隆擴增PCV-2-Cap基因的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，上游引物F：CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG

TTTCC(BamHⅠ)，下游引物R：CGGGGTACCTCACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCT(KpnⅠ)，擴增目的基因大小723 bp。

以pMD18T-PCV-2-Cap為模板，利用PCV-2-Cap特異性引物PCR擴增獲得Cap全基因。PCR體系：上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，Q5 High-Fidelity 2×Master Mix 25 μL，稀釋的質(zhì)粒模板1 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，擴增25個循環(huán)；最后72℃ 10 min。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并回收目的片段，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2重組質(zhì)粒pFastBacⅠ-Cap的構(gòu)建及鑒定將Cap基因和pFastBacⅠ空載體同時用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收目的條帶并用T4 DNA連接酶將Cap基因和pFastBacⅠ連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDpα感受態(tài)細胞。經(jīng)酶切和測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pFastBacⅠ-Cap。

1.2.3重組桿粒rBacmid-Cap的構(gòu)建和鑒定將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastBacⅠ-Cap轉(zhuǎn)化E.coliDH10BacTM感受態(tài)細胞，經(jīng)3次藍白斑篩選，挑選白色菌落培養(yǎng)。提取重組桿粒，用 pUC/M13F/R通用引物鑒定重組桿粒，鑒定正確的重組桿粒命名為rBacmid-Cap。

1.2.4重組桿狀病毒rAcMNPV-Cap的獲得、鑒定及病毒滴度的測定轉(zhuǎn)染前1 d將生長良好的Sf9細胞鋪入6孔板中，待細胞密度達到2.0×106細胞/mL，將鑒定正確的重組桿粒rBacmid-Cap(3 μg)和Cellfectin○RⅡ轉(zhuǎn)染試劑(10 μL)混合，室溫靜置20 min，轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9細胞(2.0×106細胞/mL)，27℃靜置培養(yǎng)，每天觀察細胞，待細胞出現(xiàn)變大、漂浮及破裂等細胞病變特征時收獲細胞，經(jīng)500 r/min離心5 min收集上清即為P1代重組病毒。將P1代重組病毒在Sf9細胞上連續(xù)傳代2次，獲得P3代重組病毒，4℃保存?zhèn)溆?。P3代病毒經(jīng)電鏡觀察以確定獲得重組桿狀病毒。

將生長良好的Sf9細胞鋪入6孔板(5×105細胞/mL)，27℃孵育2 h，去除培養(yǎng)基，接種倍比稀釋的重組桿狀病毒(10-1～10-8)，27℃孵育2 h后，棄去培養(yǎng)基，加入2 mL斑點培養(yǎng)基，室溫靜置20 min，27℃培養(yǎng)7 d。7 d后每孔加入1 mL(1 mg/mL)中性紅，室溫孵育2 h，用濾紙除去多余的液體，計算斑點數(shù)。

1.2.5重組Cap蛋白的鑒定野生型桿狀病毒AcMNPV和P3代重組桿狀病毒rAcMNPV-Cap分別接種6孔板中對數(shù)生長期的Sf9細胞，72 h后收獲細胞。將收獲的細胞用PBS洗滌3次，加入300 μL細胞裂解液4℃靜置30 min，加入5×上樣緩沖液(Loading buffer)煮沸5 min，12 000 r/min離心10 min，取20 μL上清進行SDS-PAGE電泳。

1.2.6間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定Cap蛋白的活性將重組桿狀病毒rAcMNPV-Cap接種6孔板中對數(shù)生長期的Sf9細胞，同時設(shè)置野生型桿狀病毒AcMNPV和正常細胞對照。72 h后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，800 mL/L的丙酮于-20℃固定10 min，PBS洗滌3次，自然風(fēng)干；加入1∶1 000稀釋的鼠源抗PCV-2-Cap蛋白單抗，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次；加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次；最后加入800 mL/L的甘油，熒光顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1PCV-2 Cap基因的擴增

PCV-2 Cap基因經(jīng)PCR擴增獲得約720 bp的目的條帶，大小與預(yù)期相符(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準DL 5 000;1，2.PCR產(chǎn)物；3.陰性對照

M.DNA Marker DL 5 000;1，2.PCR products；3.Negative control

圖1PCV-2 Cap基因的PCR擴增

Fig.1PCR amplification of PCV-2 Cap gene

2.2重組質(zhì)粒pFastBacⅠ-Cap的鑒定

將重組質(zhì)粒pFastBacⅠ-Cap用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約720 bp和4 800 bp的條帶，與預(yù)期相符(圖2)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明沒有堿基突變或缺失，讀框正確。

M.DNA 標(biāo)準DL 5 000;1.pFastBacⅠ-Cap 用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切產(chǎn)物；2.pFastBacⅠ-Cap質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 5 000;1.pFastBacⅠ-Cap digested withBamHⅠ andKpnⅠ；2. Plasmid control

圖2pFastBacⅠ-Cap的酶切鑒定

Fig.2Identification of the recombinant

pFastBacⅠ-Cap digested with enzyme

2.3重組桿粒rBacmid-Cap的鑒定

用通用引物pUCM13F/R對rBacmid-Cap進行PCR鑒定，同時設(shè)立rBacmid-pFastBacⅠ和Bacmid對照，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約3 000、2 300、300 bp的條帶(圖3)，與預(yù)期大小相符，表明重組桿粒rBacmid-Cap構(gòu)建成功。

M.DNA 標(biāo)準DL 5 000;1.rBacmid-Cap的PCR產(chǎn)物；2.rBacmid-pFastBacⅠ的PCR產(chǎn)物； 3.Bacmid的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000;1.PCR products of the rBacmid-Cap； 2.PCR product of the rBacmid-pFastBacⅠ；3.PCR products of the Bacmid

圖3rBacmid-Cap的PCR鑒定

Fig.3Identification of the recombinant rBacmid-Cap by PCR

2.4重組桿狀病毒rAcMNPV-Cap的鑒定

將P3代重組病毒進行負染電鏡觀察，可以觀察到典型的桿狀病毒粒子(圖4)，表明重組桿狀病毒rAcMNPV-Cap拯救成功。

圖4　重組桿狀病毒rAcMNPV-Cap電鏡照片(40 000×)

2.5重組桿狀病毒rAcMNPV-Cap的病毒滴度測定

通過蝕斑法測定病毒滴度，結(jié)果表明，P1代病毒滴度為5×106PFU/mL，P2代病毒滴度為1×107PFU/mL，P3代病毒滴度為6×107PFU/mL。病毒滴度滿足作為毒種的要求，同時對Cap蛋白的高效表達也是十分有利的。

2.6重組Cap蛋白的SDS-PAGE鑒定

SDS-PAGE結(jié)果表明，rAcMNPV-Cap感染Sf9細胞后能表達與Cap蛋白大小相似的蛋白(約28 ku)，而野生型桿狀病毒AcMNPV感染Sf9細胞以及正常的Sf9細胞均沒有此條帶(圖5)，說明Cap蛋白在Sf9細胞中正確的表達。

2.7重組Cap蛋白的IFA鑒定

rAcMNPV-Cap感染Sf9細胞后通過IFA可以觀察到較強的熒光，而野生型桿狀病毒AcMNPV感染Sf9細胞以及正常的Sf9細胞均沒有可見熒光(圖6)。結(jié)果表明Cap蛋白可以在Sf9細胞中正確表達，表達的Cap蛋白位于細胞漿中，并且具有良好的免疫反應(yīng)性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準;1.rAcMNPV-Cap感染Sf9細胞；2.AcMNPV感染Sf9細胞；3.正常Sf9細胞

M.Protein molecular weight Marker;1.Sf9 infected with rAcMNPV-Cap；2.Sf9 infected with AcMNPV；3.Normal Sf9

圖5重組Cap蛋白的SDS-PAGE鑒定

Fig.5Identification of recombinant Cap protein by SDS-PAGE

A.rAcMNPV-Cap感染Sf9細胞；B.AcMNPV感染Sf9細胞；C.正常Sf9細胞

A.Sf9 infected with rAcMNPV-Cap；B.Sf9 infected with AcMNPV；C.Normal Sf9

圖6IFA鑒定重組Cap蛋白(200×)

Fig.6Identification of recombinant Cap protein by IFA(200×)

3討論

1996年，PCV-2首次在加拿大被發(fā)現(xiàn)，隨后傳播到全球每一個養(yǎng)豬的國家。我國2000年首次報道了PCV-2，目前PCV-2在我國廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[11]。疫苗接種是預(yù)防PCV-2的有效手段，可以有效降低豬群的感染率，提高豬群的抗體水平以及成活率和出欄量[9,12]。國內(nèi)已有PCV-2滅活疫苗批準上市，在一定程度上降低了PCV-2的感染率。但是PCV-2在細胞上病毒滴度低，生產(chǎn)周期長，其較高的生產(chǎn)成本在一定程度上限制了PCV-2滅活疫苗的應(yīng)用。因此，亞單位疫苗成為研究者關(guān)注的新方向。研究者使用大腸埃希菌、巴斯德畢赤酵母、偽狂犬病病毒、腺病毒以及桿狀病毒等表達系統(tǒng)成功表達了Cap蛋白，并具有一定的免疫效果[8,13-14]。

桿狀病毒表達系統(tǒng)的顯著優(yōu)點是桿狀病毒與昆蟲細胞的組合可以高水平表達外源蛋白并提供良好的轉(zhuǎn)錄后修飾，使表達的蛋白具有天然的生物活性[10]。而且桿狀病毒只感染昆蟲，對脊椎動物安全，無致病性。同時昆蟲細胞可以實現(xiàn)在無血清培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)，對氣體條件要求不嚴格，因此是一種理想的蛋白表達系統(tǒng)。目前，基于桿狀病毒表達系統(tǒng)的豬圓環(huán)病毒Cap蛋白亞單位疫苗已經(jīng)上市，如勃林格殷格翰動物保健公司的該類疫苗在實際應(yīng)用中取得了一定的效果[9]。值得指出的是，基于不同的桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)和抗原純化工藝生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量也不盡相同，尤其國產(chǎn)疫苗，質(zhì)量仍有較大提升空間。

本試驗采用Invitrogen公司的商品化Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，提高了目的蛋白的表達效率，篩選獲得的重組桿狀病毒對Cap蛋白的表達量高，間接免疫熒光試驗表明，Cap蛋白具有生物活性，并且Cap蛋白分布在細胞漿，只需進行細胞裂解即可獲得Cap蛋白，因此可以作為豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗的候選株，在完成后續(xù)的免疫效果評價后，可望為PCV-2的預(yù)防提供更有效的制品。

參考文獻:

[1]扈榮良.現(xiàn)代動物病毒學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2014:734-757.

[2]Segalés J,Allan G M,Domingo M.Porcine circovirus diseases[J].Anim Health Res,2005,6(2):119-142.

[3]Ellis J,Clark E,Haines D,et al.Porcine circovirus-2 and concurrent infections in the field[J].Vet Microbiol,2004,98(2):159-163.

[4]Tischer I,Gelderblom H,Vettermann W,et al.A very small porcine virus with circular single-stranded DNA[J].Nature,1982,295(5844):64-66.

[5]Nawagitgul P,Morozov I,Bolin S R,et al.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].J Gen Virol,2000,81( 9):2281-2287.

[6]Kekarainen T,McCullough K,Fort M,et al.Immune responses and vaccine-induced immunity against porcine circovirus type 2[J].Vet Immunol Immunopathol,2010,136(3-4):185-193.

[7]Brun A,Bárcena J,Blanco E,et al.Current strategies for subunit and genetic viral veterinary vaccine development[J].Virus Res,2011,157(1):1-12.

[8]Liu L J,Suzuki T,Tsunemitsu H,et al.Efficient production of type 2 porcine circovirus-like particles by a recombinant baculovirus[J].Arch Virol,2008,153(12):2291-2295.

[9]王一平,郭龍軍,唐青海,等.豬圓環(huán)病毒2型疫苗的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2012,43(9):1337-1345.

[10]Possee R D.Baculoviruses as expression vectors[J].Curt Opin Biotech,1997,8(5):569-572.

[11]郎洪武,張廣川,吳發(fā)權(quán),等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)科技,2000,30(3):3-5.

[12]Beach N M,Meng X J.Efficacy and future prospect of commercially available and experimental vaccine against porcine circovirus type 2 (PCV-2)[J].Virus Res,2012,164(1-2):33-42.

[13]Wang X,Jiang W,Jiang P,et al.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2 (PCV-2) in mice[J].Vaccine,2006,24(16):3374-3380.

[14]Ju C,Fan H,Tan Y,et al.Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2[J].Vet Microbiol,2005,109(3-4):179-90.

Construction and Identification of a Recombinant Baculovirus Expressing Cap Protein of Porcine Circovirus Type 2

ZHANG Yong-wu,LIAN Hai,ZHANG Jin-xia,ZHANG Jing-yuan,LIU Ye,ZHANG shou-feng,HU Rong-liang

(MilitaryVeterinaryInstitute,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun,Jilin,130000,China)

Abstract:The study utilized Bac-to-Bac○Rbaculovirus expression system to generate Cap protein of porcine circovirus type 2 and identified the biological activity of Cap protein.Cap gene was cloned into pFastBacTMⅠ.The recombinant plasmid pFastBacⅠ-Cap was transformed into DH10Bac,and the recombinant rBacmid-Cap was obtained by blue-white screening.Sf9 cells were transfected with rBacmid-Cap by liposome method and recombinant baculovirus rAcMNPV-Cap was constructed.Baculovirus was observed by electron microscope.Cap protein was about 28 ku which was confirmed by SDS-PAGE.The indirect immunofluorescence assay showed that Cap protein had good immunogenicity.This study laid a foundation for the development of the subunit vaccine of porcine circovirus type 2.

Key words:Porcine circovirus type 2;Cap protein;baculovirus expression system

文章編號:1007-5038(2016)03-0014-05

中圖分類號:S852.659.2

文獻標(biāo)識碼:A

作者簡介：張永武(1989-)，男，河南南陽人，碩士，主要從事分子病毒學(xué)研究。*通訊作者

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31372456；31472214)

收稿日期：2015-09-15