尤　華，張　佳，李　箐，嚴(yán)紅亞，宋春蓮，尹革芬，舒相華，李文貴*

(1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201;3.云南省普洱市思茅區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,云南普洱 665000)

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戊型肝炎病毒在長爪沙鼠體內(nèi)消長規(guī)律研究

尤華1，張佳2，李箐3，嚴(yán)紅亞2，宋春蓮2，尹革芬2，舒相華2，李文貴2*

(1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201;3.云南省普洱市思茅區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,云南普洱 665000)

摘要：為掌握戊型肝炎病毒(HEV)感染長爪沙鼠后各組織器官中病毒的載量及消長規(guī)律，以1株云南豬源HEV感染ZCLA長爪沙鼠，采用實時熒光定量PCR相對定量法，對不同感染時間的血液、糞便及肝、腸等組織中的病毒進(jìn)行測定。結(jié)果表明，從感染3 d后開始，長爪沙鼠血液、糞便、肝、腸和膽汁中均能檢測到病毒，以腸和膽汁中含量最高，感染5周后各組織中還能檢測出病毒。研究結(jié)果為建立長爪沙鼠感染HEV模型，揭示HEV復(fù)制與疾病進(jìn)程的關(guān)系、致病機(jī)理，以及建立防控技術(shù)等奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：戊型肝炎病毒；感染模型；病毒消長；長爪沙鼠

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)引起的一種人獸共患病，主要經(jīng)污染水源傳播，也有證據(jù)表明可從其他動物、輸血或垂直傳播等途徑傳播。HEV是一種單股正鏈RNA病毒，具有變異性強(qiáng)、宿主范圍廣、易降解、不穩(wěn)定和從載毒標(biāo)本(如糞便、膽汁等)中分離高含量的純病毒較難等特性，在很大程度上限制了致病機(jī)理、越種傳播等的研究及疫苗研發(fā)。

國內(nèi)外學(xué)者對應(yīng)用恒河猴、黑猩猩、短尾猴等非人靈長類，豬、兔等動物以及傳代細(xì)胞等作為感染模型的可能性進(jìn)行了探索[1]。恒河猴、黑猩猩雖易感，但價格高、操作難，還存在醫(yī)學(xué)倫理等問題。豬、兔相對成本低，操作簡便，但豬僅感染基因3/4型，試驗操作難度大，而兔僅感染與現(xiàn)有4個基因型有很大差異(核苷酸同源性70%～83%)的兔源HEV[2]。除此以外，人胚肺二倍體傳代細(xì)胞系、豬肝臟干細(xì)胞系、人肝癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系等均可用于HEV培養(yǎng)[3]，但應(yīng)用前景遠(yuǎn)不及動物感染模型。

目前已證實長爪沙鼠對HEV易感，感染后引起的肝臟、腦組織等損傷，組織病理學(xué)變化與人感染HEV后相似[4]。然而，在作為感染模型應(yīng)用之前，還須完成長爪沙鼠對不同HEV基因型的易感性、體內(nèi)病毒載量及分布、感染后的免疫應(yīng)答等的研究。本研究以1株云南豬源HEV感染長爪沙鼠，采用實時熒光定量PCR相對定量法，對血液、糞便及肝、腸等組織中的病毒進(jìn)行了測定，為完善HEV長爪沙鼠感染模型基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步研究該病毒復(fù)制與疾病進(jìn)程的關(guān)系、揭示HEV致病機(jī)制和預(yù)防控制技術(shù)研究等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與種毒4月齡ZCLA 長爪沙鼠30只，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。種毒swYN-2為云南豬源基因4型HEV，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心分離保存。

1.1.2主要試劑質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Eastep通用型總RNA提取試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript RT、熒光染料SYBR○RPrime ExTaqTⅡ，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransHIFI PCR MIX，全式金(北京)公司產(chǎn)品；HEV-IgG ELISA 試劑盒(雙抗夾心法)，北京萬泰藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；HEV特異引物、管家參照基因各1對，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

1.2方法

1.2.1攻毒及采樣長爪沙鼠攻毒組15只，對照組15只(為防止意外死亡，各組備用1只)，用HEV IgG ELISA 試劑盒檢測抗體，結(jié)果全為陰性。試驗過程中全部單獨(dú)隔離飼養(yǎng)。

取實驗室保存的種毒swYN-2，給每只攻毒組沙鼠腹腔注射0.8 mL病毒懸液，對照組每只注射等量的生理鹽水，于攻毒后感染后第5天(5 DPI)、11、16、21、28 DPI處死攻毒組、對照組各2只，分別采集糞便、血液、膽汁、心和肝等樣本，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　試驗所用引物

1.2.2總RNA 提取與cDNA 制備

1.2.2.1總RNA提取按Eastep 通用型總RNA提取試劑盒說明書提取樣本組織的總RNA，紫外分光光度計檢測濃度并調(diào)至500 ng /μL，置-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，置-20℃保存?zhèn)溆?。普通PCR擴(kuò)增目的基因，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。用DNA 回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連結(jié)；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸埃希菌Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增；用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實時熒光定量PCR 方法按下列組分配制Real-time PCR反應(yīng)體系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL,GAPDH-F或HEV-F3(10 μmol/L)1 μL,GAPDH-R或HEV-R3(10 μmol/L)1 μL,模板2 μL,Rnase free water補(bǔ)足至20 μL。

將配制好的樣品放在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中，按以下程序進(jìn)行反應(yīng)。95℃預(yù)變性30 s；95℃ 30 s，60℃5s，共35個循環(huán)；制備熔解曲線。

2結(jié)果

2.1臨床表現(xiàn)

攻毒組ZCLA長爪沙鼠感染后部分出現(xiàn)精神萎靡，不愛活動，其中1只于攻毒后第3天死亡，病死率為 7%( 1/15) 。

2.2實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

用于制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品為含有GAPDH及HEV目的基因擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pMD18-T，對樣品進(jìn)行1、10、100、1 000、10 000倍的梯度稀釋，取5個點制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1，圖2)，GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-3.154-1=107.5%，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，Y-inter=22.277；HEV目標(biāo)基因擴(kuò)增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-3.093=110.523%，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，Y-inter=21.796。結(jié)果表明，這兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率相近，R2值都達(dá)到0.999，具有良好的重復(fù)性和精確性。

圖1　GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　HEV目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3Real-time PCR檢測HEV載量

Real-time PCR 檢測結(jié)果顯示，肝臟、腸、膽汁、糞便、血液中均能檢出HEV，陽性率達(dá)100%。從第3天就能在肝臟中檢出HEV，其中第7天含量最高，約是第3天的6倍。腸持續(xù)帶毒35 d，其中3 d～14 d病毒含量最高。第1周時膽汁中的病毒含量不斷增加，第7天達(dá)到最高值，之后明顯減少，持續(xù)帶毒5周。糞便中的HEV含量相對其他組織較少，但持續(xù)排毒35 d，第7、14天時含量最高。血液中的病毒含量在第5、7天時達(dá)到最大值，之后明顯減少，甚至檢測不到病毒(表2)。

表2　各樣品中HEV載量相對定量

3討論

戊型肝炎的公共衛(wèi)生意義越來越引起重視，但由于HEV在體外難以培養(yǎng)等原因，嚴(yán)重限制了本病毒在復(fù)制機(jī)理、致病性和跨種系傳播等領(lǐng)域的深入研究。世界各國的許多科研人員都在探索感染模型或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，近年來HEV的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已取得一些突破性進(jìn)展。已證實人胚肺二倍體傳代細(xì)胞系、豬肝臟干細(xì)胞系、人肝癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系等均可用于HEV培養(yǎng)，其中以人肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5和肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549最為高效[3]。對動物感染模型的研究表明，非人靈長類動物獼猴、黑猩猩、短尾猴等，豬、兔等家畜有望作為感染模型應(yīng)用。其中獼猴、黑猩猩已被證明是較為理想的感染模型，但價格高、操作難和醫(yī)學(xué)倫理等問題。豬、兔的成本相對較低，操作也簡便，但存在僅感染特定的基因型、豬的實驗操作存在一定難度，以及兔只對兔源HEV易感等局限。鼠類是醫(yī)學(xué)研究中最理想的感染模型，但對大鼠、小鼠等進(jìn)行的感染試驗均以失敗告終。我國科研人員發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠能感染HEV，并觀察到與豬等動物感染后相似的組織病理學(xué)表現(xiàn)[4]。不過，目前還沒有人對病毒在組織器官中的分布、消長規(guī)律，免疫應(yīng)答和抗體消長等進(jìn)行研究。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，通過揭示長爪沙鼠感染HEV過程中各器官、組織中的病毒分布及載量的消長規(guī)律，為最終建立感染模型奠定了基礎(chǔ)。

HEV感染后在宿主體內(nèi)的增殖過程還不清楚。有研究結(jié)果表明，肝臟是HEV感染的主要靶器官。自然感染和人工感染的豬均可觀察到肝臟有輕微損傷，并有病毒性肝炎的組織病理學(xué)表現(xiàn)[5]。此外，結(jié)腸、淋巴結(jié)、脾臟等其他組織器官中也能檢測到病毒[6]。加拿大科研人員Leblanc D 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HEV感染豬在不同個體組織中的分布、病毒載量差異較大。在14頭HEV陽性的屠宰豬中，病毒檢出率以肝淋巴結(jié)最高(78.6%)，其他依次為膽囊(71.4%)、肝臟(64.2%)、膽汁(57.1%)、糞便(42.9%)、扁桃體(21.4%)和血漿(7.1%)，而肌肉中檢測不到病毒。病毒載量以肝臟淋巴結(jié)、膽汁、肝臟中最高，在9.9×104-6拷貝/克之間。另有研究發(fā)現(xiàn)，人工感染的長爪沙鼠腸道黏膜上皮有大量病毒抗原分布，用HEV cDNA轉(zhuǎn)染腸癌細(xì)胞系，ORF2及ORF3均在上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表明HEV感染對腸道黏膜免疫也有一定影響[8]。本研究發(fā)現(xiàn)肝臟、膽汁和腸的病毒載量最高，但感染后3 d即可檢測到，證明長爪沙鼠對基因4型較為易感，病毒在組織器官中的分布與豬、獼猴等相同。此前已有研究表明長爪沙鼠對基因1型也易感[9]。不過，長爪沙鼠對2型、3型的易感染性有待確定。

HEV感染后，機(jī)體能成功啟動體液免疫，產(chǎn)生的IgG、IgM具有病毒中和能力，但持續(xù)時間及再次感染過程中能發(fā)揮的作用還不清楚。此外，HEV感染后細(xì)胞免疫也發(fā)揮了重要作用。對急性肝炎患者細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞群的總數(shù)增加。PBMCs中的IFN-γ在蛋白質(zhì)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平均提高。IL-2 和 TNF-α的水平?jīng)]有變化。表明分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞不屬于Th1或Tp，并和NK細(xì)胞一樣參與HEV致病過程[10]。對長爪沙鼠感染模型的研究也觀察到類似的腦組織損傷，感染后第14天，腦組織神經(jīng)元細(xì)胞呈散在變性壞死，血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤，形成血管袖套，感染28 d時在大腦皮質(zhì)可見有膠質(zhì)結(jié)節(jié)形成等[11]。醫(yī)學(xué)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，部分HEV感染患者神經(jīng)系統(tǒng)也受到損害，表現(xiàn)吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome)、臂叢神經(jīng)炎、急性橫貫性脊髓炎、神經(jīng)性肌肉萎縮，急性腦膜炎等[12]。

實時熒光定量PCR方法包括絕對定量和相對定量兩種方法。絕對定量需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；相對定量是以表達(dá)恒定的內(nèi)參基因為對照，獲得目的基因表達(dá)量的變化。絕對定量能夠獲得目的基因準(zhǔn)確的表達(dá)量，但不同樣品需要不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品，操作繁瑣[13]。此前HEV的檢測主要用套式RT-PCR方法，但已逐漸被快速、特異、靈敏并能定量的實時熒光定量RT-PCR所取代。最先建立的是針對HEV 基因組ORF2 保守區(qū)域設(shè)計引物和探針，并且針對4個基因型的HEV 毒株。如王艷坤等[14]用人源HEV感染ZCLA長爪沙鼠，實時熒光定量PCR 測定結(jié)果，糞便中第7天可測到病毒，且排毒量最高，隨后逐漸下降，排毒持續(xù)至35 d。此外，我國學(xué)者也從ORF3保守區(qū)設(shè)計引物和探針，建立了針對我國豬場普遍存在的豬基因4型的定量檢測技術(shù)[15]。由于只檢測IgM 和IgG 抗體對HEV 急性感染的早期無法做出診斷，實時熒光定量PCR在臨床診斷中的應(yīng)用越來越多。

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Study on Viral Dynamics in Gerbils Experimentally Infected with Hepatitis E Virus

YOU Hua1, ZHANG Jia2, LI Qing3, YAN Hong-ya2, SONG Chun-lian2,YIN Ge-fen2, SHU Xiang-hua2, LI Wen-gui2

(1.ChineseCenterForAnimalDiseaseControlAndPrevention,Beijing,100125,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China;3.SimaoAnimalHealthInspection,Puer,Yunnan,665000,China)

Abstract:In order to determine the viral dynamics during infection,in this study ZCLA Mongolia gerbils were experimentally infected with a genotype 4 strain isolated from Yunnan pig farms,and viral loads of HEV in blood,feces,livers and intestine tissues at different infection stages were determined by using real-time PCR.The results showed that HEV could be detected in all samples since 3 days post infection,high titers were found in intestines and biles.These results lay a good foundation for establishment of the HEV infection model,and further study of the correlation between the viral replication and the progress of disease,pathogenesis of hepatitis,prevention and control.

Key words:Hepatitis E virus;experimental infection model;virus dynamics;ZCLA Mongolia gerbils

文章編號:1007-5038(2016)03-0010-05

中圖分類號:S852.651；S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：尤華(1976-)，女，江蘇海安人，高級獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究管理工作。*通訊作者

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31160495)

收稿日期：2015-09-10