羅忠永，王　印，楊澤曉

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130)

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研究論文

豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP檢測(cè)方法的建立

羅忠永，王印*，楊澤曉

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130)

摘要：應(yīng)用通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的快速檢測(cè)方法，同時(shí)評(píng)價(jià)了該檢測(cè)方法的特異性、穩(wěn)定性和靈敏度。結(jié)果表明，根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的LAMP引物能夠在64.5℃ 60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸片段的大量擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)直接觀察反應(yīng)副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)進(jìn)行判讀，該檢測(cè)系統(tǒng)具有很高的特異性，與豬瘟病毒、豬乙型腦炎病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)；通過(guò)PRRSV不同毒株疫苗、模擬樣品和臨床樣品確定，該檢測(cè)系統(tǒng)具有很好的穩(wěn)定性；通過(guò)質(zhì)粒確定該檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)到10 拷貝/μL的病毒核酸模板。結(jié)果表明成功建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP快速檢測(cè)方法，為臨床提供了一種很好的檢測(cè)手段。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增；檢測(cè)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)也稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV，也稱豬藍(lán)耳病病毒)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。該病1987年首次在美國(guó)發(fā)生，隨后迅速在世界大范圍流行[1]。我國(guó)自1996年報(bào)道以來(lái)，該病已遍及全國(guó)各地，成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一[2-4]。2006年夏秋季節(jié)，我國(guó)南方部分省份相繼暴發(fā)“豬高熱病”疫情，診斷該病主要病原為高致病性豬藍(lán)耳病病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，該病半年內(nèi)幾乎傳遍了大半個(gè)中國(guó)，造成大批豬只死亡，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。PRRSV是一種表面相對(duì)光滑并且有囊膜的病毒，其直徑大小約50 nm～65 nm，屬于套式病毒目(Nidovirales)、動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)脈病毒屬(Arterivirus)[6]。根據(jù)PRRSV抗原性、遺傳特性和致病性將其分為兩個(gè)基因型，即歐洲Ⅰ型和美洲Ⅱ型，有研究表明美洲Ⅱ型是由歐洲Ⅰ型隔離變異而來(lái)[7]。PRRSV為單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒，基因組大小約為15 kb，結(jié)構(gòu)為5′-UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF3-ORF4-ORF5-ORF6-ORF7-UTR-poly(A)-3′，共含有10個(gè)開(kāi)放性閱讀框(ORFs)[8]。HP-PRRSV屬于美洲型，基因組結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的PRRSV有所不同，其Nsp2基因有兩處不連續(xù)的缺失，一處缺失3 nt，另一處缺失87 nt；氨基酸水平缺失30 aa[9]。病毒蛋白的表達(dá)機(jī)制是位于基因組3′端的結(jié)構(gòu)基因通過(guò)負(fù)鏈不連續(xù)轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行亞基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生6個(gè)亞基因組mRNA表達(dá)蛋白[10]。亞基因組結(jié)構(gòu)mRNAs具有與基因組相同的5′-UTR、3′-UTR、poly(A)尾巴[11]。ORF1a和ORF1b兩個(gè)開(kāi)放性閱讀框長(zhǎng)度約占基因組全長(zhǎng)的80%，分別編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab，然后分別被裂解為9種和4種非結(jié)構(gòu)蛋白[12]。ORF2-7分別編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白[13]。主要結(jié)構(gòu)蛋白為GP5、M和N蛋白。M蛋白是非糖基化的囊膜蛋白，分子質(zhì)量約為18 ku～19 ku，是所有毒株中最保守的結(jié)構(gòu)蛋白，M蛋白不僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，也可刺激產(chǎn)生最強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，在細(xì)胞免疫中起著重要作用[14]。

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社獨(dú)立研發(fā)的一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的核酸擴(kuò)增方法[15]。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的特征是針對(duì)目標(biāo)DNA鏈上的6個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)4個(gè)不同的引物，然后再利用鏈置換反應(yīng)在一定的溫度下(60℃～65℃)、經(jīng)一個(gè)步驟即可完成[16]。擴(kuò)增效率極高，可在15 min～60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增[17]，且有高度的特異性，只需根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的有無(wú)即可對(duì)靶序列的存在與否做出判斷[18]?；诖?，本研究選擇M蛋白基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的LAMP方法。

1材料與方法

1.1材料

豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等病毒疫苗均為市售產(chǎn)品；豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽(yáng)性病料(農(nóng)業(yè)部推薦RT-PCR檢疫標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證)，本實(shí)驗(yàn)室保存；PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)、DdeⅠ內(nèi)切酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；BstDNA聚合酶、大片段，NEB(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)從GenBank下載PRRSV美洲型和歐洲型參考毒株的M蛋白基因序列或從全基因組序列中找出M蛋白基因序列，利用 DNA Star5.0軟件分析M蛋白基因序列中的保守片段，利用PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò)增PRRSV M蛋白部分核酸序列的引物；利用在線引物設(shè)計(jì)軟件(http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer)設(shè)計(jì)用于構(gòu)建LAMP擴(kuò)增質(zhì)粒模板的引物。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，PAGE純化。引物信息見(jiàn)表1。使用酶切位點(diǎn)在線分線軟件(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)分析篩選用于檢驗(yàn)LAMP反應(yīng)的內(nèi)切酶。

表1　豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP檢測(cè)引物和質(zhì)粒模板構(gòu)建引物

1.2.2質(zhì)粒模板構(gòu)建使用寶生物工程(大連)有限公司RNAiso Plus提取PRRSV疫苗核酸，使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；使用天根生化科技(北京)有限公司2×Pfu PCR MaserMix擴(kuò)增M蛋白部分序列，50 μL反應(yīng)體系；PCR 擴(kuò)增后取5 μL 10 g/L瓊脂糖凝膠確認(rèn)正確擴(kuò)增后，剩余45 μL用8 g/L瓊脂糖凝膠分離，通用型DNA純化回收試劑盒回收目的片段；使用加A反應(yīng)液對(duì)純化后的平末端加A用于TA克隆，20 μL反應(yīng)體系；加A后產(chǎn)物直接用于連接T-Vector pMDTM19(Simple)，反應(yīng)體系10 μL(模板與載體的摩爾比3∶1～5∶1)，連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Dpα感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選挑取白色菌落過(guò)夜培養(yǎng)用質(zhì)粒小提取試劑盒提取質(zhì)粒，用Thermo NANODROP 2000分光光度計(jì)測(cè)量核酸濃度，并將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒送交英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序引物：M13 primer F(CAGGAAACAGCTATGAC)和M13 primer R(GTTTTCCCAGTCACGA)。

1.2.3豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP檢測(cè)方法的建立LAMP反應(yīng)體系為25 μL ,即10×ThermoPol緩沖液2.5 μL,MgSO4(100 mmol/L)1.5 μL,dNTP混合液(10 mmol/L) 3.5 μL,FIP/BIP(40 μmol/L)1 μL,F3/B3(5 μmol/L)1 μL,BstDNA聚合酶，大片段(8 000 U/mL)1 μL，DNA模板2 μL,Betaine(4 mol/L)5 μL,無(wú)核酸酶水5.5 μL。反應(yīng)條件為64.5℃恒溫60 min。反應(yīng)產(chǎn)物用DdeⅠ內(nèi)切酶驗(yàn)證。反應(yīng)優(yōu)化，夾逼法[19]60℃～68℃摸索反應(yīng)體系的最適反應(yīng)溫度。

1.2.4特異性檢驗(yàn)用豬瘟病毒、豬乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒檢驗(yàn)檢測(cè)體系的特異性，加入PRRSV疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)核酸酶水作為陰性對(duì)照；陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物使用DdeⅠ內(nèi)切酶驗(yàn)證。

1.2.5穩(wěn)定性檢驗(yàn)使用PRRSV不同毒株或不同來(lái)源疫苗，模擬樣品(參考文獻(xiàn)[19])，臨床樣品(陽(yáng)性病料，農(nóng)業(yè)部推薦RT-PCR檢疫標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證)對(duì)檢測(cè)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，無(wú)核酸酶水作為陰性對(duì)照；隨機(jī)挑取陽(yáng)性產(chǎn)物使用DdeⅠ內(nèi)切酶驗(yàn)證。

1.2.6靈敏度檢驗(yàn)使用1.2.2建立的質(zhì)粒模板，10倍梯度稀釋100拷貝/μL～104拷貝/μL，檢驗(yàn)檢測(cè)體系的靈敏度，無(wú)核酸酶水作為陰性對(duì)照；陽(yáng)性產(chǎn)物使用DdeⅠ內(nèi)切酶驗(yàn)證。

2結(jié)果

2.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP檢測(cè)方法的建立與反應(yīng)優(yōu)化

參照夾逼法[20]原理依據(jù)引物的退火溫度選擇60℃和65℃兩個(gè)溫度，結(jié)果65℃產(chǎn)物可見(jiàn)明顯的渾濁，產(chǎn)物經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)與設(shè)計(jì)相符的梯狀電泳條帶，啞鈴狀條帶出現(xiàn)在雙鏈50 bp～100 bp之間，與設(shè)計(jì)相符；產(chǎn)物經(jīng)DdeⅠ內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證。推測(cè)反應(yīng)體系最適溫度在65℃左右，選擇63℃和68℃兩個(gè)溫度，結(jié)果63℃產(chǎn)物可見(jiàn)明顯的渾濁，瓊脂糖電泳及酶切驗(yàn)證。推測(cè)反應(yīng)體系最適溫度在63℃～65℃之間，通過(guò)PCR儀在63℃～65℃之間設(shè)置8個(gè)溫度梯度，最終確定64.5℃為反應(yīng)體系最適溫度(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 500;NC.陰性對(duì)照；1.63℃；2.63.2℃；3.63.6℃；4.63.9℃；5.64.2℃；6.64.5℃；7.65℃

M.DNA Marker DL 500;NC.Negative control；1.63℃；2.63.2℃；3.63.6℃；4.63.9℃；5.64.2℃；6.64.5℃；7.65℃

圖1溫度優(yōu)化

Fig.1Temperature optimization

2.2特異性檢驗(yàn)

用豬瘟病毒、豬乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒檢驗(yàn)檢測(cè)體系的特異性，結(jié)果僅陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果出現(xiàn)明顯的渾濁，30 g/L瓊脂糖凝膠電泳和DdeⅠ內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證陽(yáng)性擴(kuò)增(圖2)。

2.3穩(wěn)定性檢驗(yàn)

使用PRRSV不同毒株或不同來(lái)源疫苗，模擬樣品，臨床樣品(陽(yáng)性病料，農(nóng)業(yè)部推薦RT-PCR檢疫標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證)對(duì)檢測(cè)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗7株不同毒株或不同來(lái)源疫苗擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性(圖3)，模擬樣品(200 μL正常組織研磨液中加入2 μL質(zhì)粒模版)陽(yáng)性，臨床樣品24份中僅1份為陰性，與農(nóng)業(yè)部推薦檢疫標(biāo)準(zhǔn)符合率為95.8%，陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增，隨機(jī)挑取2份陽(yáng)性產(chǎn)物使用DdeⅠ內(nèi)切酶酶切證明擴(kuò)增正確(圖4)。

2.4靈敏度檢驗(yàn)

利用質(zhì)粒模板，10倍梯度稀釋在100拷貝/μL～104拷貝/μL，檢驗(yàn)檢測(cè)體系的靈敏度，結(jié)果顯示101拷貝/μL時(shí),產(chǎn)物可見(jiàn)較為明顯的渾濁，30 g/L瓊脂糖凝膠電泳條帶明亮清晰，100拷貝/μL時(shí)產(chǎn)物無(wú)肉眼可見(jiàn)的明顯渾濁，30 g/L瓊脂糖凝膠電泳條帶極為不清晰，部分條帶缺失；陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增，101拷貝/μL陽(yáng)性產(chǎn)物使用DdeⅠ內(nèi)切酶酶切證明擴(kuò)增正確(圖5)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 500;PC.陽(yáng)性對(duì)照；NC.陰性對(duì)照；1.豬圓環(huán)病毒2型;2.豬偽狂犬病病毒;3.豬細(xì)小病毒;4.豬乙型腦炎病毒;5.豬瘟病毒

M.DNA Marker DL 500;PC.Positive control；NC.Negative control；1.PCV-2；2.PRV；3.PPV；4.JEV；5.CSFV

圖2特異性檢驗(yàn)

Fig.2Specificty test

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 500;1.HuN4-F112 株；2.CH-1R 株；3.R98株；4.CH-1R 株；5.JXA1-R 株；6.CH-1R 株；7.JXA1-R株；NC.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 500;1.HuN4-F112 strain；2.CH-1R strain；3.R98 strain；4.CH-1R strain；5.JXA1-R strain；6.CH-1R strain；7.JXA1-R strain；NC.Negative control

圖3穩(wěn)定性檢驗(yàn)

Fig.3Stability test

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 500;1～24.臨床陽(yáng)性樣品

M.DNA Marker DL 500;1-24.Positive clinical samples

圖4符合率檢驗(yàn)

Fig.4Compliance rate test

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 500;9～0.109拷貝/μL～100拷貝/μL

M.DNA Marker DL 500;9-0.109copies/μL-100copies/μL

圖5靈敏度檢驗(yàn)

Fig.5Sensitivity test

3討論

本檢測(cè)反應(yīng)體系參考榮研生物科技(中國(guó))有限公司生產(chǎn)的 Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào)SLP204/SLP206 )和其他學(xué)者的研究成果[21-23]，未對(duì)Mg2+濃度、BstDNA聚合酶酶量等進(jìn)行優(yōu)化，僅對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，該檢測(cè)反應(yīng)體系具有很好的適應(yīng)范圍，在63℃～65℃之間均有明顯的擴(kuò)增；選取64.5℃作為反應(yīng)溫度是對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物渾濁度、瓊脂糖凝膠電泳清晰度、引物二聚體量等綜合考量后做出的優(yōu)化。沒(méi)有優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，檢測(cè)體系并未加入LoopF/R引物是參考了其他研究者的研究結(jié)果[16]，避免非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。

本次選取不同毒株或不同來(lái)源的豬瘟病毒疫苗7株、豬乙型腦炎病毒疫苗1株、豬細(xì)小病毒疫苗5株、豬圓環(huán)病毒2型疫苗5株、豬偽狂犬病病毒疫苗7株，對(duì)該檢測(cè)反應(yīng)體系特異性進(jìn)行檢驗(yàn)，確保檢測(cè)體系特異性；同時(shí)通過(guò)不同毒株或不同來(lái)源的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗共6株，包括HuN4-F112株、CH-1R株、R98株、JXA1-R株和模擬陽(yáng)性樣品，臨床樣品對(duì)檢測(cè)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)。特別是對(duì)24份保存的農(nóng)業(yè)部推薦的RT-PCR檢疫標(biāo)準(zhǔn)鑒定為陽(yáng)性臨床樣品的檢測(cè)，兩者的符合率高達(dá)95.8%，保證本檢測(cè)體系檢測(cè)結(jié)果的可信度，對(duì)本檢測(cè)方法的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

LAMP的核心是利用鏈置換型DNA聚合酶形成如同啞鈴狀的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)LAMP反應(yīng)體系建立的難點(diǎn)在于引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)的難易取決于擴(kuò)增序列的選擇。尋找特異保守的擴(kuò)增序列是整個(gè)試驗(yàn)的關(guān)鍵，筆者在對(duì)PRRSV核酸序列研究中發(fā)現(xiàn)PRRSV M蛋白基因較為保守[4，11-14]，依據(jù)M蛋白核酸序列設(shè)計(jì)的引物具有很好的檢出率和特異性，推測(cè)M蛋白核酸序列還具有核酸提取過(guò)程中不易斷裂的特性，是PRRSV核酸檢測(cè)很好的靶基因序列。同時(shí)本試驗(yàn)還有一個(gè)難點(diǎn)是引物量的使用，本試驗(yàn)在前期預(yù)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)加入LoopF/R引物會(huì)形成較多的引物二聚體，因此參考其他研究者的做法[16]，本試驗(yàn)中未加入LoopF/R引物；由于沒(méi)有找到可行的FIP/BIP、F3/B3的使用量及比例優(yōu)化方案，盡管在綜合考慮引物二聚體量后對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，但反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳仍可見(jiàn)明顯的引物二聚體結(jié)構(gòu)，因此仍需在更深入的研究基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。

我國(guó)自1996年報(bào)道PRRS以來(lái)，已遍及全國(guó)各地，成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一[2-4]。對(duì)PRRSV的快速準(zhǔn)確檢測(cè)是控制PRRS傳播重要措施。本試驗(yàn)根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒M 蛋白基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的LAMP引物能夠在64.5℃、60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸片段的大量擴(kuò)增，反應(yīng)僅需一個(gè)恒溫水浴鍋，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)直接觀察反應(yīng)副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)判斷，該檢測(cè)系統(tǒng)具有極高的特異性和穩(wěn)定性；與農(nóng)業(yè)部推薦檢疫標(biāo)準(zhǔn)符合率高達(dá)95.8%，為豬繁殖與呼吸綜合征病毒提供了一個(gè)快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

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Development of a LAMP Method for PRRSV

LUO Zhong-yong，WANG Yin，YANG Ze-xiao

(AnimalQuarantineLaboratory,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgricultureUniversity,Chengdu,Sichuan,611130,China)

Abstract:A rapid detection method for porcine reproductive and respiratory syndrome virus was established by using the universal reverse transcription kit and loop-mediated isothermal amplification technology,and the specificity,stability,sensitivity of the detection were evaluated.The results showed that the target nucleic acid fragment can be amplified in 64.5℃ within 60 min using the LAMP primers designed according to porcine reproductive and respiratory syndrome virus M protein gene conservative region,the test results can be directly observed by the naked eye through the reaction-products (magnesium pyrophosphate),the detection system has high specificity,and viruses such as classical swine fever virus,porcine Japanese encephalitis virus showed no cross reaction;the good stability of the detection system was confirmed by different strains of vaccines,simulated samples and clinical samples;the plasmid-template which is just 10 copies/μL in concentration was detected by the detection system.The test results proved that the LAMP method of rapid detection for porcine reproductive and respiratory syndrome virus was successfully established.

Key words:PRRSV;LAMP;detection

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0001-05

中圖分類號(hào):S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：羅忠永(1992-)，男，河南潢川縣人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支持計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD12B04)

收稿日期：2015-10-05