虞兆芳

摘 要：從20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的微分相稱干涉顯微鏡，其主要功能是對未經(jīng)染色的透明生物樣品進(jìn)行觀察。當(dāng)前該技術(shù)在顯微成像技術(shù)中的應(yīng)用已十分廣泛，并且在生物醫(yī)學(xué)研究中也得到普遍使用。DIC成像技術(shù)的原理主要是將樣品中梯度的變化轉(zhuǎn)為強(qiáng)度的變化，并且對光干涉產(chǎn)生相應(yīng)位移的一階導(dǎo)數(shù)信息進(jìn)行顯示。DIC顯微鏡技術(shù)在成像中有著熒光纖維成像技術(shù)沒有的非侵入性優(yōu)勢，有不需要樣品進(jìn)行標(biāo)記和實(shí)施染色的優(yōu)點(diǎn)，可以更好地幫助檢測研究人員對沒有經(jīng)過任何處理的樣品進(jìn)行觀察，在應(yīng)用中具有十分重要的意義。

關(guān)鍵詞：DIC成像；優(yōu)勢；創(chuàng)新

中圖分類號：TN27 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

在自然狀態(tài)下的細(xì)胞一般是透明的，并且在傳統(tǒng)顯微鏡下，其對比度很低，有的甚至無法看到。為此在很長一段時(shí)間，人們?yōu)樘嵘鈱W(xué)顯微鏡的對比度進(jìn)行了很長一段時(shí)間的研究。在具體研究中提升光學(xué)顯微鏡成像效果的技術(shù)主要有兩種：外源對比度法和內(nèi)源對比度法。外源對比度法要在成像樣品中加入化合物，隨后通過在光照條件下發(fā)光來觀察實(shí)物。這種方法的優(yōu)點(diǎn)很多，但同時(shí)會產(chǎn)生一些副作用。而內(nèi)源光對比度法的原理是分析光通過樣品時(shí)產(chǎn)生的相位變化來提供被觀察物品的具體信息，因此該方法具有無毒和非侵入的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。下面我們就對內(nèi)源光對比法技術(shù)中的優(yōu)勢和創(chuàng)新方法進(jìn)行介紹。

1.DIC成像技術(shù)介紹

提高光學(xué)顯微成像的分辨率是光學(xué)顯微鏡研究的主要目標(biāo)，DIC成像技術(shù)的依據(jù)為阿貝爾衍射理論。在光學(xué)顯微鏡中產(chǎn)生阻礙的主要是光的波動(dòng)性，光學(xué)顯微鏡的分辨率被限制后，在對物理尺寸小于波長大小的物品觀察中，光學(xué)顯微鏡能夠探測到該體的存在，但無法完成對該物體的測量。例如，在熒光顯微鏡中可以觀察到亞波長的單分子，但是不能分辨兩個(gè)靠得很近的單分子。

阿貝爾極限的推導(dǎo)需要特定的條件， 我們假設(shè)阿貝爾衍射的極限可以被打破。例如，掃描近場顯微鏡可以對衍射限制進(jìn)行突破，它的實(shí)現(xiàn)是在光源大小以及樣品同探測器之間的距離得到保證的基礎(chǔ)上得到的。非線性效應(yīng)也能實(shí)現(xiàn)對阿貝爾衍射的突破，其實(shí)近年來已實(shí)現(xiàn)了突破。例如在激光發(fā)射損耗顯微鏡的發(fā)明中，保證在激發(fā)射顯微鏡的基礎(chǔ)上，另外加上一臺激光器，并在原來的掃描點(diǎn)周圍產(chǎn)生環(huán)形的損耗區(qū)，造成熒光損耗現(xiàn)象。可增加激光的光強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)損耗區(qū)域面積的擴(kuò)大，進(jìn)一步縮小熒光分子的有效區(qū)域。光學(xué)顯微鏡的研究學(xué)者在對以上技術(shù)的應(yīng)用中，得到幾十個(gè)納米掃描點(diǎn)。阿貝爾衍射極限的突破也是在對光源進(jìn)行改造的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的，最終產(chǎn)生了光學(xué)顯微鏡的頻域限制通頻帶，解碼至高頻區(qū)域，對光學(xué)顯微鏡頻譜范圍實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)展。相應(yīng)地，更高頻的成分對應(yīng)著更為精細(xì)的結(jié)構(gòu)，在獲取高頻成分的條件下，實(shí)現(xiàn)對更加精細(xì)樣品結(jié)構(gòu)的觀察，使成像分辨率提高，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對阿貝爾衍射極限的打破。

2.DIC成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

DIC成像技術(shù)與其他成像技術(shù)相比，最根本的區(qū)別就在于光學(xué)基礎(chǔ)不同，在具體的應(yīng)用中通過比較可以得知，DIC成像技術(shù)在成像中，決定比度的主要因素是在光通路中的梯度變化，梯度大的區(qū)域在人的觀察視野中對比度高，并且會呈現(xiàn)“偽立體”效果，在梯度比較小的區(qū)域中，例如對比較扁平的上皮細(xì)胞的觀察，則不會有明顯的對比度呈現(xiàn)，并且其灰度值和通常狀況下的背景相同。

除了在成像機(jī)制上的優(yōu)勢外，DIC成像技術(shù)中不存在相差成像等技術(shù)中出現(xiàn)的光暈，并且利用DIC成像技術(shù)還可以檢測到細(xì)胞表面分布著不同程度的細(xì)菌，這是很多成像技術(shù)所觀察不到的。在DIC成像中我們可以清楚地看到環(huán)狀結(jié)構(gòu)的半球形中的放射結(jié)構(gòu)，并且其中的顆粒狀結(jié)構(gòu)肉眼可以觀測到。DIC成像技術(shù)的主要優(yōu)勢在于不需要對相差環(huán)和聚光鏡換遮擋等因素進(jìn)行考慮，可以直接實(shí)現(xiàn)高數(shù)值孔徑的物鏡觀察。這充分說明了DIC可以提高軸向的分辨率，這在對分辨率要求十分高的實(shí)驗(yàn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3.小結(jié)

本文對DIC成像技術(shù)進(jìn)行了簡單的介紹，對該技術(shù)中的創(chuàng)新元素展開了一定的論述，闡述了該技術(shù)提高成像分辨率的原理。

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