洪祥美吳 琦

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分子遺傳標(biāo)記在動(dòng)物育種中的應(yīng)用研究

洪祥美1吳 琦2

（1.南京市溧水區(qū)永陽街道畜牧獸醫(yī)站，江蘇南京211200；2.南京市溧水區(qū)石湫畜牧獸醫(yī)站，江蘇南京211200）

隨著分子遺傳新技術(shù)的出現(xiàn)，分子遺傳標(biāo)記也隨之迅速發(fā)展，從而帶動(dòng)整個(gè)現(xiàn)代遺傳學(xué)的發(fā)展。本文系統(tǒng)地論述了RFLP、RAPD、微衛(wèi)星DNA、AFLP和SNP等分于遺傳標(biāo)記的研究概況及其在動(dòng)物育種中的應(yīng)用，并針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀及存在的問題探討了分子遺傳標(biāo)記在將來發(fā)展的前景與趨勢(shì)。

分于標(biāo)記；動(dòng)物育種

分子遺傳標(biāo)記是近些年來隨著分子遺傳學(xué)和各種DNA重組技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的，它的出現(xiàn)使人們可以從遺傳標(biāo)記的角度對(duì)動(dòng)物遺傳育種來進(jìn)行分析，其中DNA多態(tài)性的研究在遺傳標(biāo)記中占據(jù)著重要地位。對(duì)于DNA多態(tài)現(xiàn)象，是由個(gè)體的基因差異引起了DNA在分子水平上的差異。相比于其他分子標(biāo)記，其具有一下特點(diǎn)：DNA可以利用一些直接的分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行分析，減少了通過表型性狀推測(cè)基因型而造成的誤差；可用來進(jìn)行選擇的DNA分子類型多；分子遺傳標(biāo)記所包含的信息含量比蛋白質(zhì)大；DNA樣品的獲取比較方便；在多數(shù)生物的遺傳中，DNA多態(tài)性普遍，準(zhǔn)確度高，遺傳穩(wěn)定，并且易于通過個(gè)體水平的多態(tài)情況分析群體中的遺傳多樣性，確定許多個(gè)體的同源性關(guān)系。

想要獲得更加理想的分子標(biāo)記需要包含的條件有：（1）等位基因易于辨別；（2）具多態(tài)性程度高；（3）共顯性遺傳；（4）分子標(biāo)記能夠均勻分布于整個(gè)基因組；（5）易于檢測(cè)，重復(fù)性好；⑹無基因多效性等。常見的分子遺傳標(biāo)記包括：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLPs）、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記等。

1 限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）

限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上的堿基存在著插入、缺失、重排或點(diǎn)突變，影響著基因型之間的限制性長(zhǎng)度差異，這種差異被稱為RFLP。對(duì)基因組DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切割，利用放射性標(biāo)記探針與Southern 印跡轉(zhuǎn)移后的支持膜雜交，經(jīng)放射顯影顯示出RFLP譜帶。在譜帶上會(huì)出現(xiàn)不同程度的多態(tài)性，造成這些多態(tài)性的原因是因?yàn)榛蚪MDNA在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)發(fā)生了插入、重排、點(diǎn)突變以及片段缺失、，使得酶切位點(diǎn)長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生了變化。

RFLP和PCR -RFLP在動(dòng)物遺傳育種研究領(lǐng)域日漸廣泛，檢測(cè)動(dòng)物線粒體［1］、BoLA、SLA復(fù)合體［2］、生長(zhǎng)激素基因座［3］、蘭定尼受體基因（RYR1）［4］、性別決定基因（SRY /sry）［5］及雌激素受體基因（ESR）［6］等的多態(tài)性，從而可以了解到許多動(dòng)物遺傳信息，例如群體之間的種屬關(guān)系，分析群體的遺傳多樣性，起源與分化，并且能夠與畜牧生產(chǎn)中得到的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，便于遺傳圖譜的繪制等。

2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）

作為一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)，RAPD技術(shù)最早是在Wiliams和Welsh等在1990年同時(shí)提出的［6-7］。通過人工合成的大約10bp的引物，對(duì)基因組進(jìn)行DNA PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性。缺點(diǎn)在于在區(qū)分雜合子和純合子時(shí)，易受到顯隱性共存的影響；另外，由于反應(yīng)靈敏，RAPD擴(kuò)增易受外源及DNA污染的干擾，并且會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差的情況。

目前，RAPD已在分子標(biāo)記、動(dòng)物遺傳資源分析和鑒定等多個(gè)方面廣泛應(yīng)用。王克華等［9］曾利用24個(gè)RAPD引物中篩選的4多態(tài)性引物對(duì)7個(gè)地方雞種的群體遺傳距離進(jìn)行分析。曹冶等［8］利用6條RAPD引物共擴(kuò)增出334個(gè)條帶四川乳肉兼用牛及其父母本的遺傳進(jìn)行了距離鑒定。

3 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記

微衛(wèi)星標(biāo)記也稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是一類由幾個(gè)核苷酸（一般不超過4個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星DNA散布于整個(gè)基因組，而不同的重復(fù)次數(shù)及程度導(dǎo)致了座位間多態(tài)性的產(chǎn)生。通過對(duì)微衛(wèi)星序列的兩端進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，并對(duì)微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度進(jìn)行比對(duì)，我們便可以得到不同基因型個(gè)體的每個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)多態(tài)性。通過這種多態(tài)性研究，針對(duì)動(dòng)物的某些重要基因進(jìn)行定位研究。而鑒于微衛(wèi)星標(biāo)記方法有數(shù)量多、易鑒別、分布廣等特點(diǎn)。已在動(dòng)物遺傳育種的分子標(biāo)記當(dāng)中被廣泛應(yīng)用。如張劍等［10］采用29對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)北京油雞保種群進(jìn)行了遺傳多樣性檢測(cè)，并通過等位基因頻率、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）等的計(jì)算分析了群體內(nèi)的遺傳變異。

4 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）

將RFLP與PCR相結(jié)合，基因組的DNA片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增的技術(shù)稱之為AFLP。首先，我們根據(jù)物種和品種的不同，對(duì)研究的功能基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，而由于通過DNA酶切之后，隨機(jī)片段的分子量大小不一，所以在經(jīng)PCR擴(kuò)增之后，可以簡(jiǎn)單地通過電泳的方法來分離鑒別，觀察擴(kuò)增后產(chǎn)生擴(kuò)增片段的多態(tài)性。其特點(diǎn)在于：DNA用量少；多態(tài)性好；重復(fù)性好；樣品適用性廣等。

5 SNP標(biāo)記

SNP是指基因組中DNA某一特定核苷酸在位置上存在置換、插入、缺失等變化。SNP主要有以下方法：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性；基因芯片技術(shù)；毛細(xì)管電泳技術(shù)等。目前SNP技術(shù)被廣泛應(yīng)用與疾病診斷，物種進(jìn)化和種群鑒定。尤其在動(dòng)物育種當(dāng)中，SNP已成為非常好的工具來研究特定性狀。黃孫平等［11］對(duì)雞的PRLR基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，并于產(chǎn)蛋性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)，表明PRLR基因可作為提高雞群產(chǎn)蛋性能潛在的分子標(biāo)記。

6 存在的問題與前景展望

對(duì)于DNA多態(tài)性的研究，作為目前對(duì)動(dòng)物遺傳育種標(biāo)記的重要手段，已廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物遺傳育種的實(shí)踐當(dāng)中。有效且有意義的DNA多態(tài)性，對(duì)于實(shí)現(xiàn)遺傳圖譜的構(gòu)建，具有重要意義。同時(shí)，利用遺傳標(biāo)記提供的基因型，能夠有效地對(duì)畜禽的一些經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行選擇，為動(dòng)物育種提供一定的支持。但是目前所發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記均有一定的局限性。例如RFLP標(biāo)記座位通常所涉及到的等位基因會(huì)存在基因頻率過低的情況，并且RAPD標(biāo)記在系中的穩(wěn)定性和特異性不能保證，所以利用RFLP標(biāo)記的效率存在一定的問題。除此之外，DNA標(biāo)記仍需要進(jìn)行標(biāo)記的統(tǒng)一，沒有準(zhǔn)確和參考性強(qiáng)的DNA標(biāo)記作參照，會(huì)導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)的鑒別會(huì)出現(xiàn)一定的差異。因此，在進(jìn)行標(biāo)記分析工作之前，對(duì)DNA標(biāo)記的篩選和標(biāo)準(zhǔn)化尤為重要。與此同時(shí)，在檢測(cè)工作中的實(shí)驗(yàn)操作，取樣方法以及樣品污染等問題都亟待解決。

目前，對(duì)遺傳標(biāo)記的分析，主要采用極大似然、分離群體法和LOD值作圖法等方法對(duì)標(biāo)記與數(shù)量性狀基因座（QTL）進(jìn)行遺傳連鎖分析。但是在QTL定位中的運(yùn)用遺傳分子標(biāo)記還存在以下困難：（1）因?yàn)镼TL存在多基因的微效性，所以要建立多樣化的參照群，很難講其效應(yīng)分開區(qū)別；（2）在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中，在家畜中建立一定標(biāo)準(zhǔn)的參照系十分困難，因?yàn)楂@取近交系和分離狀態(tài)的標(biāo)記基因具有一定難度，所以檢測(cè)到的QTL數(shù)目會(huì)因此減少；（3）對(duì)于同一性狀的不同基因座和不同性狀的同一基因座存在一定的相互作用，并且基因座在染色體上的交錯(cuò)分布，會(huì)使得QTL的定位難以確定。

綜上所述，盡管在進(jìn)行分子遺傳標(biāo)記的過程當(dāng)中仍然存在許多問題和挑戰(zhàn)，但對(duì)于動(dòng)物育種而言，分子遺傳標(biāo)記隨著各種新方法和新工具的出現(xiàn)，其發(fā)展也會(huì)愈加迅速。而標(biāo)記基因的性狀研究和標(biāo)記基因數(shù)目的與日俱增，分子遺傳標(biāo)記為數(shù)量遺傳學(xué)提供分子水平的信息，也為家畜育種的進(jìn)一步發(fā)展提供了材料，現(xiàn)代育種也將進(jìn)入分子育種階段。標(biāo)記基因能夠?yàn)閯?dòng)物的屠體性狀，繁殖性狀和抗病性狀提供輔助選擇和性狀相關(guān)基因的定位，通過利用分子技術(shù)，使得利用數(shù)量遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)對(duì)動(dòng)物的數(shù)量性狀進(jìn)行遺傳改良提供便利。

7 結(jié)束語

隨著人們對(duì)基因的研究愈加深入，分子遺傳標(biāo)記也將在動(dòng)物育種中越發(fā)具有重要性。分子遺傳標(biāo)記在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用，對(duì)家畜的性狀研究，良種改造，遺傳圖譜繪制及起源等發(fā)面提供有力幫助。因此，分子遺傳標(biāo)記在動(dòng)物育種中的應(yīng)用將成為今后動(dòng)物育種的重點(diǎn)。

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