李鵬飛 高懷峰

（榆陽區(qū)畜牧技術(shù)推廣站，陜西榆陽 719000）

兩種纖維素降解菌對粗飼料的混合發(fā)酵研究

李鵬飛 高懷峰

（榆陽區(qū)畜牧技術(shù)推廣站，陜西榆陽 719000）

本實驗以粗飼料為發(fā)酵對象，利用微生物發(fā)酵原理，通過PDA固體培養(yǎng)基平板拮抗實驗，得到兩種纖維素降解菌菌株—酵母菌和黑曲霉菌，采用PDA液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，并對不同配方的粗飼料同時進行分別接種和混合接種，在25℃下（設(shè)對照組）固體發(fā)酵。隨著原粗飼料中粗蛋白、粗纖維含量的下降，發(fā)酵飼料的粗蛋白、粗纖維變化量有上升趨勢。通過微生物發(fā)酵，提高了粗飼料的莒養(yǎng)成分，改善了粗飼料的適口性。

粗飼料；酵母菌；黑曲霉菌；混合發(fā)酵

1 研究內(nèi)容

1.1實驗儀器、設(shè)備

分析天平、恒溫箱、樣品粉碎機、高壓滅菌鍋、冰箱、無菌接種箱、照相機、燒杯、試管、培養(yǎng)皿、溫度計、凱氏定氮儀、菌種培養(yǎng)機制備實驗儀器及飼料質(zhì)量檢測的常規(guī)儀器和試劑等。

1.2實驗材料

1.2.1培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，磷酸氫銨0.1%，硫酸鎂0.05%。

1.2.2固體發(fā)酵原料

玉米秸稈、統(tǒng)糠、麩皮、蔗糖、尿素、石粉、食鹽。

1.2.3菌種

實驗室保存的純種酵母菌和黑曲霉菌。

1.3實驗方法

1.3.1菌種的活化和制備

（1）菌種培養(yǎng)基的制備：PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基），即稱取30g去皮馬鈴薯（未出芽），切成小塊，加水煮沸20分鐘，用4～6層紗布過濾，配置成20%馬鈴薯浸汁；加入2%葡萄糖，加熱煮沸后再加入2%瓊脂，繼續(xù)加熱溶化并補足失水定容150ml；分裝與6支試管和3個平板中（試管裝15ml，平板裝20ml），采用高壓滅菌鍋滅菌1h，取出后降試管擺放成斜面冷卻。

（2）接種：在無菌接種箱中采用化線法接種。每個處理作3個重復(fù)。注意在換菌種時，切記要將接種針在酒精燈火焰上灼燒，進行滅菌，且當其恢復(fù)適宜溫度時，接種下一種菌種于培養(yǎng)基上。

（3）菌種培養(yǎng)：在25±0.1℃下培養(yǎng)，待長滿菌絲后取出備用。

1.3.2菌種間拮抗試驗

（1）材料：上述PDA固體培養(yǎng)基平板和上述制備好的酵母菌和黑曲霉菌。

（2）接種：在無菌接種箱中采用點種法接種。作3個重復(fù)。注意在換菌種時，切記要將接種針在酒精燈火焰上灼燒，進行滅菌，且當其恢復(fù)適宜溫度時，接種下一種菌種于培養(yǎng)基上。

（3）倒置培養(yǎng)：在25±0.1℃下倒置培養(yǎng)3～5d，觀察、記錄、拍照。

1.3.3固體發(fā)酵實驗

（1）菌種的擴大培養(yǎng)：PDA液體培養(yǎng)基，即稱取所需去皮馬鈴薯（出芽的馬鈴薯不能用），切成小塊，加水煮沸20min，用4～6層紗布過濾，配置成20%馬鈴薯浸汁；加入2%的葡萄糖、0.2%的蛋白胨、0.1%的磷酸二氫鉀、0.05%的硫酸鎂，繼續(xù)加熱溶化并補足失水定容300ml；分裝入6個錐形瓶中；采用濕熱滅菌法滅菌1h，冷卻后在無菌接種箱中接種（2瓶接黑曲霉菌，四瓶接酵母菌），在27.5℃、1500r/min的搖床培養(yǎng)48h。

（2）培養(yǎng)基：按照固有配方做固體發(fā)酵培養(yǎng)基于玻璃瓶中（每瓶50g），每樣做三個重復(fù)，共需玻璃瓶份數(shù)：（酵母菌×3+黑曲霉菌×3+混合菌×3）×3種配方+3對照組=30份；（加水量為60%）。將玻璃瓶封口后采用濕熱滅菌法滅菌1h，待冷卻后接種。

（3）接種：在無菌接種箱接種，接種量為：酵母菌為20%；黑曲霉菌10%，接種方法為：先接種酵母菌10%，7d后再在接種酵母菌和黑曲霉菌各10%。然后在20℃左右培養(yǎng)25d后測其指標。

1.3.4實驗驗指標測定

（1）粗蛋白測定：半微量凱氏定氮法。（2）粗纖維的測定：GBT 6434-2006［26］。

（3）pH值測定：準確稱取10g飼料樣品，溶解于100ml蒸餾水中，沉淀15min，過濾，用精密pH試紙測定稀釋液的pH值。

2 實驗結(jié)果

2.1菌種的拮抗試驗

菌種拮抗試驗結(jié)果為：酵母菌與黑曲霉菌不發(fā)生拮抗，在開始培養(yǎng)前24h內(nèi)酵母菌生長旺盛，黑曲霉菌用肉眼幾乎看不到菌絲，48h可見黑曲霉菌有少數(shù)菌絲出現(xiàn)，72h黑曲霉菌菌絲數(shù)量幾乎和酵母菌菌絲數(shù)量相當，此后黑曲霉菌迅速生長，菌絲數(shù)量遠遠超過酵母菌?？傊?，試驗的兩種菌種不發(fā)生拮抗，但由于黑曲霉菌后期生長能力強而發(fā)生營養(yǎng)競爭導致酵母菌生長較弱，因此，在作固體發(fā)酵時可將酵母菌與黑曲霉菌的接種比例定為2：1，先接種酵母菌10%，7d后再在接種酵母菌和黑曲霉菌各10%。

2.2固體發(fā)酵實驗

2.2.1發(fā)酵實驗前后粗飼料中粗蛋白的變化分析

通過對比分析可知，采用不同配方和不同方法發(fā)酵后，發(fā)酵粗飼料中的粗蛋白都有不同程度大上升，其中酵母菌發(fā)酵的變化較小，最高為62.32%，黑曲霉菌的最高變化為144.81%，兩種菌種混合后變化最大，最高達224.85%。

2.2.2發(fā)酵實驗前后粗飼料中粗纖維的變化分析

由實驗結(jié)果分析可知，采用不同配方和不同方法發(fā)酵后，發(fā)酵粗飼料中的粗纖維都有不同程度大下降，其中酵母菌發(fā)酵的變化較小，最高為-25.95%，黑曲霉菌的最高變化為-40.93%，兩種菌種混合后變化最大，最高達-50.52%。

3 結(jié)論

經(jīng)微生物發(fā)酵后，粗飼料中的粗蛋白和粗纖維都有不同程度的變化。無論是采用單獨發(fā)酵還是混合發(fā)酵，發(fā)酵飼料中的粗蛋白含量極顯著提高，最高達到224.51%，發(fā)酵飼料中的粗纖維含量極顯著下降，最大下降率達50.33%。另外，采用混合菌發(fā)酵比各菌株單獨發(fā)酵效果極明顯；黑曲霉菌的發(fā)酵效果比酵母菌明顯。而且，隨著原粗飼料中粗蛋白、粗纖維含量的下降，發(fā)酵飼料的粗蛋白、粗纖維變化量有上升趨勢。

［1］吳文韜，鞠美庭，劉金鵬，等.一株纖維素降解菌的分離、鑒定及對玉米秸稈的降解特性［J］.微生物學通報，2013，40（4）：712-719.