趙 莉

（遼寧省鞍山市臺安縣動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧鞍山 114100）

淺析影響血凝和血凝抑制試驗的因素

趙 莉

（遼寧省鞍山市臺安縣動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧鞍山 114100）

血凝和血凝抑制試驗是獸醫(yī)實驗室檢測禽流感、新城疫免疫抗體的最常用方法之一。它也是檢查防疫質(zhì)量的重要依據(jù)。但在實驗操作過程中，經(jīng)常受到各種因素的影響，造成實驗結(jié)果誤差。

血凝；血凝抑制試驗；診斷

1 被檢樣品

1.1 樣品的采集

隨機(jī)采集的樣品要能夠代表整個雞群。一般情況下，同一批次的抽檢比例為1～5%。日齡不同，免疫時間不同的樣品，應(yīng)分開編號，不能混在一起編號。采血部位一般以靜脈為主。采血時，將注射器活塞向后拉一小段，留出部分空間。對采血部位先進(jìn)行酒精棉消毒，干燥后進(jìn)行采血取樣。取樣時動作要緩慢平穩(wěn)，避免刺破靜脈。取樣后，將注射器稍傾斜，便于血清的析出。

1.2 被檢血清

血樣在運輸過程中要盡量避免振蕩和搖晃，以免溶血。一般情況下氣溫在25℃以上時全血易凝固，若氣溫過低可在培養(yǎng)箱中孵育，待血清析出后3000r/min離心2～5min，即可得到淡黃色透明血清樣品。血清樣品要及時進(jìn)行檢測，如不能及時檢測，需在5d內(nèi)檢測的樣品可放在4℃保存，超過一周要放在-20℃環(huán)境下冷凍。被檢血清應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則抗體會降低。

2 反應(yīng)板的選擇

HA與HI試驗結(jié)果的準(zhǔn)確與否與V型反應(yīng)板的質(zhì)量密切相關(guān)。建議反應(yīng)板應(yīng)選擇一次性使用96孔V型反應(yīng)板，板面及凹孔干凈，板面應(yīng)水平，不能彎曲、傾斜。

3 抗原效價的測定及試劑配制

3.1 抗原的保存

抗原應(yīng)按照說明保存。進(jìn)行抗原效價測定時應(yīng)做回滴實驗，避免出現(xiàn)誤差。測定好效價的抗原如一次不能用完應(yīng)分裝到滅菌離心管內(nèi)，并標(biāo)明日期和效價，每管的量最好是一次使用的量，避免反復(fù)凍融。

3.2 稀釋液

HA、HI試驗的緩沖體系是0.01M pH7.2PBS，并保持整個試驗各步驟緩沖體系的一致。緩沖液最好先用現(xiàn)配，高壓滅菌后使用，冷藏放置一般不超過一個月，PBS放置時間過長或出現(xiàn)絮狀沉淀時不宜再使用。稀釋液的pH值應(yīng)控制在7.2。pH值在5.8以下紅細(xì)胞易自凝，pH值在7.8以上凝集圖像易消失，而pH值在7.2時紅細(xì)胞沉淀最充分，圖形最清晰，HI效價也最高。

3.3 紅細(xì)胞懸液

配制1%紅細(xì)胞懸液，最好選擇采取2～3只SPF雞，或未進(jìn)行任何免疫的成年公雞血。配制過程中須吸取試管底部的紅細(xì)胞進(jìn)行稀釋配制，若吸取上層紅細(xì)胞則可能導(dǎo)致紅細(xì)胞懸液濃度偏低。配好的紅細(xì)胞原液4℃保存?zhèn)溆?，試驗中使用?%紅細(xì)胞懸液要現(xiàn)用現(xiàn)配，另外不可使用破裂溶血的紅細(xì)胞進(jìn)行試驗。

4 加樣

病毒懸液和紅細(xì)胞懸液在使用前一定要搖勻，以保證每孔中加入的濃度和數(shù)量準(zhǔn)確一致，避免加入的濃度和數(shù)量高低不一，造成誤差。搖晃紅細(xì)胞懸液時力度不宜過大，防止紅細(xì)胞破裂，造成溶血。

加液體時，一定要保持移液器吸頭與反應(yīng)板之間的距離，避免吸頭與反應(yīng)板中的液體接觸造成污染。

稀釋血清時，動作要緩慢，避免產(chǎn)生氣泡，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。

5 溫度和時間

溫度通常應(yīng)在20～25℃，室溫不適宜的情況下應(yīng)置于恒溫箱內(nèi)。溫度高于37℃時，紅細(xì)胞很快沉降下來，導(dǎo)致試驗不成立；低于20℃時反應(yīng)速度減慢，在規(guī)定時間內(nèi)觀察，對照結(jié)果不成立。加入紅細(xì)胞放置時間應(yīng)按照規(guī)定時間及時觀察，超過10min以上，紅細(xì)胞發(fā)生裂解。

［1］ 王孟華.淺析影響血凝和血凝抑制試驗的因素［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2004，26（6）：51-52.