李玉文 董在坤 邢春偉

（唐山市漢沽管理區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北唐山 301501）

淺談奶牛結(jié)核病診斷技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展

李玉文 董在坤 邢春偉

（唐山市漢沽管理區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北唐山 301501）

奶牛結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的人畜共患傳染病，其傳播流行影響畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的健康。結(jié)核病的早期預(yù)防與陽性牛淘汰措施仍是控制疫情的主要手段。近年來，隨著細(xì)菌學(xué)檢測和血清檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)核病診斷方法有了很大進(jìn)展，本文就結(jié)核病的診斷技術(shù)進(jìn)行綜述。

奶牛結(jié)核病；診斷；檢測

近年來，由于奶產(chǎn)品消費(fèi)逐步加大，隨著全國大市場、大流通的進(jìn)一步形成，奶牛交易頻繁，奶牛結(jié)核病的發(fā)生呈逐步上升趨勢，嚴(yán)重影響著動(dòng)物源性公共衛(wèi)生安全，極大危險(xiǎn)著人民群眾的身體健康，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。奶牛結(jié)核病的診斷大體上可歸為兩類：一是臨床癥狀診斷；二是實(shí)驗(yàn)室診斷，包括細(xì)菌學(xué)檢測，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等；免疫學(xué)檢測；分子生物學(xué)診斷技術(shù)等。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法由于繁瑣費(fèi)時(shí)，檢出率低，靈敏度差，已不能滿足當(dāng)前疫病診斷的需要。目前世界各國都在致力于研究開發(fā)奶牛結(jié)核病診斷的快速方法，并已經(jīng)建立了一些快速、準(zhǔn)確、可靠的新型檢測技術(shù)，有些技術(shù)已經(jīng)在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛的應(yīng)用。

1 細(xì)菌學(xué)檢測

細(xì)菌學(xué)檢測的方法有涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等。臨床上樣品中的牛分枝桿菌可通過涂片抗酸染色、鏡檢并通過細(xì)菌培養(yǎng)做出確認(rèn)。涂片抗酸染色法所需材料設(shè)備簡單，操作方法簡便，是較為普遍應(yīng)用的方法。由于此方法檢出的細(xì)菌只能說明有抗酸桿菌存在，而且也不能準(zhǔn)確的鑒定出結(jié)核分枝桿菌和非典型分枝桿菌，因此，其缺乏特異性。細(xì)菌培養(yǎng)需在37℃培養(yǎng)3～8周才可生長。菌落形態(tài)粗糙，中心隆起，周圍大而邊緣不規(guī)則，菌落顏色微白。細(xì)菌培養(yǎng)法到目前為止仍被認(rèn)為是確診結(jié)核的黃金標(biāo)準(zhǔn)。但牛結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，有10～20%的病例結(jié)核菌培養(yǎng)失敗。同時(shí)由于各種條件的影響，陽性率較難提高。

2 血清學(xué)檢測

2.1 牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（PPD）

PPD是目前公認(rèn)最有效的方法，也是被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）確定的法定的檢測方法，也是被世界各國接受和采用的方法。它主要是用提純的PPD進(jìn)行牛皮內(nèi)接種，于72～120h后觀察有無熱、痛、腫脹等反應(yīng)，對(duì)可疑的奶牛需60d后再次復(fù)檢。該方法檢出率和準(zhǔn)確率都比較高。PPD作為皮膚實(shí)驗(yàn)最大的缺點(diǎn)就是容易出現(xiàn)假陽性和假陰性反應(yīng)。當(dāng)感染副結(jié)核分枝桿菌等環(huán)境分枝桿菌時(shí)則可能呈現(xiàn)假陽性反應(yīng)，即PPD中大多數(shù)蛋白質(zhì)與其他分枝桿菌和一些無關(guān)細(xì)菌的相同。對(duì)因感染其他分枝桿菌而致敏的動(dòng)物沒有特異性，不能判斷病情，而且BCG疫苗中含有與PPD相同的抗原成分，因而PPD皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)不能鑒別是免疫動(dòng)物還是感染動(dòng)物。在一些國家，使用比較結(jié)核菌素試驗(yàn)（即比較皮內(nèi)試驗(yàn)），在頸部一側(cè)的不同部位，同時(shí)注射牛型PPD和禽型PPD以判斷動(dòng)物對(duì)兩種PPD的不同反應(yīng)，能夠提示被檢奶牛是被牛型分枝桿菌感染還是非特異的DTH反應(yīng)。所以以PPD作為診斷工具的TST反應(yīng)很難將結(jié)核菌顯性感染和隱形感染以及BCG免疫的個(gè)體反應(yīng)分開來。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

此類方法是利用抗原抗體反應(yīng)檢測針對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌抗原的循環(huán)抗體。目前用于檢測的抗原有PPD、ESAT-6、CFP10、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80、MPB83、Ag85、LAM（脂阿拉伯甘露聚糖）、LPS（脂多糖）等。ELISA中也可以利用免疫過氧化物酶，這種方法與傳統(tǒng)的ELISA方法相比檢測速度更快、成本更低、操作更簡便。

2.3 r-干擾素試驗(yàn)

將試驗(yàn)牛血樣的淋巴細(xì)胞加入特異性PPD一起孵育16-24h，由于致敏的淋巴細(xì)胞能夠釋放出r-干擾素，因此可用INF-r-ELISA進(jìn)行定量測定。通過對(duì)結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)的研究表明ESAT-6蛋白僅存在于結(jié)核桿菌復(fù)合體及少數(shù)致病性結(jié)核分枝桿菌中，90%以上的分枝桿菌不具有ESAT-6蛋白，因而將ESAT-6蛋白作為刺激抗原來檢測釋放到血中的INF-r水平是診斷牛結(jié)核病的較好方法。免疫學(xué)試驗(yàn)證明在ESAT-6蛋白上存在著T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，這極大地推動(dòng)了以ESAT-6作為診斷試劑的研究價(jià)值。r-干擾素試驗(yàn)優(yōu)于結(jié)核菌素試驗(yàn)的一個(gè)特點(diǎn)就是，即使動(dòng)物體內(nèi)抗原很少也能被檢出，且可重復(fù)檢查。由于接種了BCG使PPD試驗(yàn)很難對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染作出診斷，因此，迫切需要建立一個(gè)新的細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測方法，而全血INF-r檢測方法很有可能成為替代傳統(tǒng)的結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)核病臨床輔助診斷方法。

2.4 淋巴細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)

致敏的外周血淋巴細(xì)胞（PBL）在特異性抗原（如PPD、MPB70、MPB64等）刺激下，可使抗原特異性T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生增生反應(yīng)。通過測定外周血循環(huán)中的增生淋巴細(xì)胞的比例可了解淋巴細(xì)胞增生的程度，間接反映淋巴細(xì)胞被特異性抗原致敏的情況，從而分析動(dòng)物抗體對(duì)于牛分枝桿菌的細(xì)胞免疫狀態(tài)。淋巴細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)主要是測定全血樣品對(duì)結(jié)核菌素PPD抗原的細(xì)胞反應(yīng)，因其費(fèi)用較高，難于大面積使用?？偟膩碇v，血清學(xué)試驗(yàn)的低敏感性歸因于分枝桿菌感染引起的抗體免疫反應(yīng)是細(xì)胞免疫占主導(dǎo)而非體液免疫。因此，血清學(xué)試驗(yàn)最好是作為細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)的補(bǔ)充而不是替代。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

3.1 PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)人結(jié)核和牛結(jié)核的診斷有很高的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用PCR可檢測出250fg分枝桿菌純化DNA菌細(xì)胞的敏感度為50個(gè)菌，且整個(gè)檢測過程僅需2d，蔡宏等用基因探針原位雜交技術(shù)檢測用福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的牛分枝桿菌，在幾天內(nèi)就可獲知分析結(jié)果。該法省去了為從組織中提取結(jié)核菌而進(jìn)行的組織研磨處理結(jié)核桿菌DNA提取等繁瑣步驟，敏感度為104～105個(gè)細(xì)菌/ml。

3.2 RFLP技術(shù)和Spoligotyping技術(shù)

RFLP技術(shù)和Spoligotyping技術(shù)主要用于結(jié)核病流行病學(xué)，對(duì)結(jié)核菌型的鑒定有重要意義。該方法只需少量的DNA直接利用細(xì)菌裂解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，不需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)來提取DNA。

4 奶牛結(jié)核病快速診斷技術(shù)

由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研究開發(fā)2種能夠特異性鑒別奶牛結(jié)核病原的方法，能夠檢測到50pg的牛分枝桿菌的DNA，只需3h即可獲得鑒定結(jié)果。1）PCR檢測方法選擇結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體中的特有基因esat-6基因?yàn)镻CR擴(kuò)增的目的基因，通過特異性和敏感性分析，建立以esat-6為目的基因的PCR檢測方法，該方法具有快速、敏感和特異的特點(diǎn)，其敏感性和特異性到達(dá)了國外同類產(chǎn)品的檢測水平；2）ELISA檢測方法將多種特異性較高的抗原以串連融合的形式在大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，生產(chǎn)出牛結(jié)核病診斷抗原，通過對(duì)臨床樣品的檢測結(jié)果顯示，本研究建立的ELISA方法能夠快速檢測出結(jié)核陽性病牛，具有很好的特異性和開發(fā)前景。

5 結(jié)語

牛結(jié)核病的控制和永久根除需要政府部門和廣大獸醫(yī)工作者的共同努力下才能實(shí)現(xiàn)。提高診斷技術(shù)和研究更有效的疫苗是實(shí)現(xiàn)結(jié)核病根除的有效方法。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有亞單位疫苗、活載體疫苗和新型DNA疫苗的問世，為牛結(jié)核病的檢測和預(yù)防提供了一條嶄新的途徑。

［1］ 孫科敏，范鋒，范承和.奶牛結(jié)核病防治技術(shù)研究進(jìn)展［J］.科學(xué)種養(yǎng)，2014，（9）：52.

［2］ 蔣柏茂，李文平，劉從松，等.奶牛結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國奶牛，2009，（4）：38-40.

［3］ 張玉海，賀玲玲，王俊江.淺談奶牛結(jié)核病的病征與診斷及其防控策略［J］.養(yǎng)殖與飼料，2009，（1）：22-23.