程 瑤 劉 識 朱子成 欒非時

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

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西瓜糖含量相關性狀的QTL分析

程 瑤 劉 識 朱子成 欒非時*

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

摘 要：以高糖西瓜品系花園母本為母本、低糖西瓜品系LSW-177為父本配制雜交組合，構建含有125個單株的F2S7重組自交系群體（RILs），利用CAPS分子標記構建了1張包含245個CAPS標記、11個連鎖群的遺傳連鎖圖譜，該圖譜覆蓋基因組長度2 423.9cm，標記間的平均距離9.9cm。采用復合區(qū)間作圖法對西瓜糖含量相關性狀進行QTL分析，定位到與可溶性固形物相關的QTL 4個，表型貢獻率分別為14.80%、11.50%、32.10%、8.60%；與果糖相關的QTL 3個，表型貢獻率分別為8.80%、20.50%、9.50%；與蔗糖和葡萄糖相關的QTL各1個，表型貢獻率分別為11.34%、24.10%。這9個QTL均表現(xiàn)為對糖含量的正加性效應，表明系高糖西瓜品系花園母本提供了對糖含量的貢獻。

關鍵詞：西瓜；CAPS；遺傳連鎖圖譜；糖含量；QTL

程瑤，女，碩士研究生，專業(yè)方向：西瓜分子遺傳育種，E-mail：chengyao504934423@163.com

西瓜（Citrullus lanatus）起源于非洲南部的干旱地區(qū)，是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的園藝作物（Hashizume et al.，2003）。西瓜糖含量是決定西瓜感官品質和商品價值的重要性狀之一，西瓜果實中主要的可溶性糖是蔗糖、葡萄糖和果糖（張帆 等，2006）。農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室以高糖西瓜品系花園母本和低糖西瓜品系LSW-177為親本材料，對西瓜果實可溶性糖含量的遺傳規(guī)律和QTL定位分別進行了研究。欒非時等（2014）以6世代群體為材料研究了果糖、蔗糖和葡萄糖的遺傳模型，結果表明，葡萄糖、果糖、蔗糖含量均為主基因+多基因的數(shù)量性狀遺傳模型。劉識等（2013）對F2群體的180個單株進行SSR標記，構建西瓜的遺傳連鎖圖譜，對西瓜果實中心和邊緣部分的3種可溶性糖以及總糖含量分別進行了QTL分析，由于所用標記較少，只檢測到與中心和邊緣總糖含量相關的QTL位點各1個，沒有檢測到與果糖、蔗糖、葡萄糖相關的QTL位點。國內(nèi)外對于西瓜可溶性糖含量QTL定位的研究較少，Ren等（2014）利用整合的西瓜遺傳連鎖圖譜對果實可溶性糖含量進行QTL分析，定位到5個與果糖相關的QTL，1個與葡萄糖相關的QTL，3個與蔗糖相關的QTL。

目前用于西瓜遺傳連鎖圖譜構建和基因定位的分子標記主要有基于分子雜交的RFLP標記（Restriction Fragment Length Polymorphism）和基于PCR 擴增的 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、SSR（Simple Sequence Repeat）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、SRAP標記（Sequence Related Amplified Polymorphism）（Hashizume et al.，1996；易克 等，2003；Levi et al.，2006）。Levi 等（2006）指出，SSR和RAPD標記的多態(tài)性較低，AFLP多態(tài)性高但容易聚集在幾個連鎖群上，因此不能覆蓋全基因組，且上述標記在染色體上的多態(tài)性是隨機的。Levi等（2009）從100 條西瓜 EST（Expressed Sequenced Tag）單基因序列中開發(fā)出 40 對 SSR 引物，并對其可用性和多態(tài)性進行了驗證和分析。隨著高通量測序技術的發(fā)展，基因組測序為遺傳標記的開發(fā)提供了新的思路和方法。Ren等（2012）基于97103和PI296341-FR 的基因組測序數(shù)據(jù)開發(fā)了大量的SSR、InDel（Insertion and Deletion）和SV（Structure Variation）標記。 SNP（Single Nucleotide Polymorphism）單核苷酸多態(tài)性指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A，T，C ，G）的替換而引起的多態(tài)性。1996年Lander第1次正式提出SNP為新一代分子標記，它具有共顯性、穩(wěn)定遺傳、易于轉化等優(yōu)點（Esteras et al.，2012）。目前檢測SNP常用的方法是DNA芯片技術，而利用全基因組測序結果挖掘SNP并將其轉化為可開發(fā)的遺傳標記的研究卻鮮有報道。

本試驗利用高通量測序技術對高糖西瓜品系花園母本和低糖西瓜品系LSW-177進行重測序，經(jīng)過生物信息學分析，在基因組上尋找SNP位點，將其轉化為CAPS標記，對重組自交系F2S7群體的125個單株進行標記，構建西瓜遺傳連鎖圖譜。挖掘與可溶性固形物、果糖、蔗糖、葡萄糖相關的QTL位點，為西瓜糖含量的分子標記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

母本材料是栽培西瓜品系花園母本，由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院西甜瓜分子育種研究室提供，該品系可溶性固形物含量高（中心部位10.28%）、中熟（從授粉到瓜成熟35 d）。父本材料LSW-177來源于美國，由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究署西南農(nóng)業(yè)試驗站Angela R.Davis博士提供，其特點是可溶性固形物含量低（中心部位8.59%）、中熟（從授粉到瓜成熟35 d）（Davis et al.，2008）。以花園母本和LSW-177配制雜交組合，獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2，其后代通過單粒傳的形式連續(xù)自交獲得由125個單株組成的 F2S7重組自交系群體（RILs）。

1.2田間試驗

2014年4月將父母本、F1和F2S7125個單株種植于東北農(nóng)業(yè)大學香坊農(nóng)場的5號塑料大棚內(nèi)，田間試驗采用隨機區(qū)組設計，親本、F1及F2S7群體，每個株系每小區(qū)種植3株，3次重復，株距50cm，行距80cm。采用吊蔓栽培，雙蔓整枝。自第2朵雌花開始授粉，為避免營養(yǎng)競爭，每株僅留1個瓜。授粉35 d后收獲西瓜果實，果實縱切，用手持糖度計測量中心部位的可溶性固形物含量，可溶性固形物含量用Brix表示。稱取中心部位的西瓜果肉5 g放于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3糖含量的測定

西瓜果肉可溶性糖含量的測定參照萬學閃等（2009）的方法，略有改動。利用比色法，分別測量中心部位果糖、蔗糖和葡萄糖含量（張紅 等，2009）。將5 g西瓜果肉用勻漿機破壁處理，加入10 mL 80%乙醇溶液，混勻后放于80 ℃水浴鍋中浸提40 min，加入2 g活性炭脫色20 min，10 000 rpm離心30 min，吸取上清液，并將殘渣重復上述操作，合并上清液，定容至25 mL待用。果糖和蔗糖含量采用蒽酮比色法測定，還原糖含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，用所得的還原糖數(shù)值減去果糖數(shù)值即為葡萄糖數(shù)值，設置3次重復，取平均值。試驗過程中，吸光值的測定和標準曲線的繪制均用酶標儀完成。

1.4表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

每個性狀取其3次重復的平均值。使用Microsoft Excel 2003軟件以及SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與相關性分析。

1.5DNA的提取

出苗21 d后，取9株父母本、F1及RILs生長點部位的幼嫩真葉放入自封袋，標明株系號，采用改良的CTAB法提取基因組DNA（Murray & Thompson，1980）。

1.6CAPS標記的開發(fā)

本試驗中用到的CAPS 標記是基于花園母本和LSW-177基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的，參考基因組數(shù)據(jù)以已經(jīng)發(fā)布的西瓜基因組數(shù)據(jù)為準。用11種不同的限制性內(nèi)切酶（EcoR Ⅰ，BsaH Ⅰ，Hind Ⅲ，Mbo Ⅱ，Pst I，Sca Ⅰ，BamH Ⅰ，Mlu Ⅰ，Asu Ⅱ，Dra Ⅰ 和Pvu Ⅰ）對序列進行酶切位點分析，在酶切位點上下游100～500 bp設計引物。每條染色體上平均設計40～70個CAPS引物，利用Primer Premier 6軟件進行引物的設計。PCR體系參照盛云燕等（2006）的方法，擴增程序采用梯度PCR擴增：94 ℃預變性7 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5℃；94 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃終止延伸7 min。酶切體系為：1μL限制性內(nèi)切酶緩沖液，0.5μL限制性內(nèi)切酶（10 U·μL-1，THERMO），9μL超純水，PCR擴增產(chǎn)物5μL，37 ℃水浴2 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物命名原則為WC+羅馬數(shù)字+酶切位點所在染色體號+引物編號。

1.7遺傳圖譜的構建和QTL分析

利用 JoinMap 4.0軟件對篩選出的分子標記進行分析并構建遺傳圖譜。 采用 Kosambi 函數(shù)計算圖距，選擇LOD值≥3.0，用Map命令構建連鎖圖譜。QTL分析使用Windows QTL Cartographer V 2.5軟件。采用1 000 次重復置換測驗，估算基因組范圍內(nèi)α= 0.05 水平上的 LOD閾值。以LOD值≥3.0為閾值。采用復合區(qū)間作圖法（CIM），以 1.0cm步行速度在全基因組內(nèi)進行掃描（Doerge & Churchill，1996）。QTL命名方式為性狀英文縮寫+連鎖群號+ QTL 編號。使用MapChart 2.1軟件繪制遺傳連鎖圖譜，根據(jù)分子標記在染色體上的位置，依次將連鎖群命名為LG1～LG11，對應染色體chr1～chr11。

2　結果與分析

2.1果實糖含量在親本及RILs群體中的分布

西瓜果實糖含量在親本和RILs群體中的表現(xiàn)列于表1，花園母本的可溶性固形物、果糖、蔗糖和葡萄糖含量均高于LSW-177。在RILs群體中，各性狀均表現(xiàn)出明顯的超親分離，但總的趨勢是介于兩親本之間，可溶性固形物、果糖、葡萄糖偏向于母本，蔗糖則明顯偏向于父本。由圖1可知，各性狀在RILs群體中呈連續(xù)分布，峰度、偏度均小于1（表1），符合正態(tài)分布，屬于數(shù)量性狀，可以進行QTL分析。

2.2糖含量的相關性分析

由表2可知，可溶性固形物與果糖、蔗糖、葡萄糖均存在顯著或極顯著正相關，果糖與蔗糖和葡萄糖均存在極顯著正相關，但蔗糖與葡萄糖存在極顯著負相關。

圖1　可溶性固形物、果糖、葡萄糖、蔗糖在RILs群體中的頻率分布

表1　西瓜果實糖含量在親本及RILs群體中的分布

表2　可溶性固形物、果糖、蔗糖和葡萄糖的Pearson相關性分析

表3　CAPS標記在西瓜遺傳圖譜上的分布

2.3CAPS標記多態(tài)性和偏分離分析

共設計CAPS引物524對，篩選出在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的CAPS標記278個，多態(tài)率53.1%。在這278個標記中有58個標記表現(xiàn)出偏分離，占20.9%。其中有38個標記偏向于花園母本，占65.5%，20個標記偏向于父本，占34.5%。發(fā)生偏分離的標記有4個未歸入任何連鎖群，其他的54個標記分布在11個連鎖群上，其中2號和11號連鎖群居多，2號連鎖群上有20個標記且全都偏向于母本，11號連鎖群上有7個標記且全部偏向于父本。分布在1號連鎖群上的偏分離標記3個，3號連鎖群3個，4號連鎖群3個，5號連鎖群1個，6號連鎖群4個，7號連鎖群4個，8號連鎖群2個，9號連鎖群5個，10號連鎖群2個。

2.4遺傳連鎖圖譜構建

用278個表現(xiàn)多態(tài)性的CAPS標記對重組自交系的125個群體進行分析，LOD值≥3.0的圖上標記有245個，分布在11個連鎖群上，覆蓋全基因組長度2 423.9cm，標記間的平均距離9.9cm，這11個連鎖群長度范圍在63.6～373.0cm之間，其中最小的連鎖群是第8連鎖群，最大的是第10連鎖群，包含標記最多的是第3連鎖群，含有32個標記（表3、圖2）。

2.5糖含量QTL分析

利用Windows QTL Cartographer V 2.5復合區(qū)間作圖法對重組自交系群體的果實糖含量進行QTL分析，共檢測到與糖含量相關的QTL位點9個，結果如表4、圖2所示。其中控制可溶性固形物的位點4個，據(jù)連鎖群不同分別命名為BRX2-1、BRX2-2、BRX6-1 、BRX9-1；果糖含量的QTL3個，分別命名為Fru2-1、Fru6-1 、Fru7-1；蔗糖和葡萄糖的位點各1個，分別命名為Suc9-1、Glu6-1。這9個QTL對西瓜果實糖含量均表現(xiàn)為正的加性效應，表明系高糖西瓜品系花園母本對糖含量的貢獻。

4個與可溶性固形物相關的QTL貢獻率范圍在8.60%～32.10%，累計貢獻率為67.00%，其中BRX6-1貢獻率為32.10%，大于15%，為主效QTL位點。BRX2-1、BRX9-1與相鄰標記間的距離在3cm以內(nèi)，BRX2-2與標記WCI02-28和WCI02-27的距離小于1cm，表明可溶性固形物與這2個標記緊密連鎖。

與果糖相關的3個QTL分別定位在第2 、6、7連鎖群上，累計貢獻率38.80%，其中Fru6-1貢獻率20.50%，為主效QTL位點。Fru2-1與標記WCI02-29、WCI02-28緊密連鎖，F(xiàn)ru7-1與標記WCI07-26緊密連鎖。

控制葡萄糖含量的位點Glu6-1分布在第6連鎖群上，貢獻率為 24.10%，LOD值6.3，為主效QTL位點。

圖2　西瓜遺傳連鎖圖譜及糖含量QTL位點左側為遺傳距離（cM），右側為分子標記和QTL位點，BRX表示可溶性固形物，F(xiàn)ru表示果糖，Glu表示葡萄糖，Suc表示蔗糖。

與蔗糖相關的QTL定位在第9連鎖群上，貢獻率為 11.34%，與標記WCI09-36間的距離小于1cm，緊密連鎖。

表4　西瓜果實糖含量QTL遺傳效應分析

3　結論與討論

3.1CAPS標記的開發(fā)和遺傳圖譜的構建

西瓜遺傳距離狹窄，栽培品種間同工酶等生化標記和 RAPD 等分子標記的多態(tài)性十分有限（Zamir et al.，1984；Zhang & Rhodes，1993；Levi et al.，2001），西瓜全基因組測序的完成和高通量測序技術的發(fā)展為分子標記開發(fā)提供了新的思路與方法。本試驗在西瓜基因組重測序基礎上，發(fā)掘單個核苷酸突變位點，將其轉化為CAPS標記，與SSR、AFLP、RAPD等標記相比，CAPS標記操作方便，結果穩(wěn)定可靠，為共顯性標記，重要的是引物與限制酶有多種組合，多態(tài)性高（王春明 等，2003）。

利用生物信息學軟件對重測序的數(shù)據(jù)進行分析，共找到在親本間有多態(tài)性的SNP位點352 483個，用11種不同的限制性內(nèi)切酶分析，找到可以轉化為CAPS標記的位點28 722個，如果增加限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量，可開發(fā)的CAPS標記的數(shù)量是巨大的。本試驗共設計CAPS引物524對，篩選出在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的CAPS標記278個，多態(tài)率53.1%，而本實驗室篩選的SSR標記多態(tài)性只有10.1%，這在劉識等（2013）的論文中已有報道。

重組自交系是將雜種后代經(jīng)單粒傳連續(xù)自交至完全純合的一系列品系 ，由此構成的群體可以永久使用，該群體是構建遺傳圖譜和 QTL 定位的最佳材料（易克 等，2004）。本試驗用RILs群體構建了1張以CAPS標記為主的遺傳圖譜，該圖譜包含11個連鎖群，覆蓋全基因組長度2 423.9cm，標記間平均距離小于10cm，可以用作QTL分析。試驗中采用的CAPS標記是在重測序的基礎上開發(fā)的，標記在染色體上的位置是已知的，因此這11個連鎖群可以和西瓜的11對染色體一一對應。圖譜中最小的連鎖群是第8連鎖群，含有25個標記，長度只有63.6cm，Ren等（2014）在整合圖譜時也發(fā)現(xiàn)第8連鎖群最短，因此推斷8號染色體可能是最小的染色體。由圖2、表3中可以看出該圖譜還不夠密集，還需要進一步加密，為基因定位及分子標記輔助育種提供更多有價值的信息。

3.2標記的偏分離分析

偏分離是遺傳作圖研究中的一種普遍現(xiàn)象，是一種重要的進化動力，自交不親和性和遺傳搭車效應（hitchhiking）（即分子標記偏分離程度與影響等位基因頻率的遺傳因子連鎖有關。在一些連鎖群中存在著控制配子生活力和競爭力的座位，其結果是導致配子選擇從而產(chǎn)生偏分離）是目前解釋偏分離現(xiàn)象的兩種觀點（Xu et al.，1998）。一般而言，DH 群體和 RILs 群體偏分離的比率要高于F2群體。Levi 等（2006）在用一個測交群體〔Griffin14113（C.lanatus var.citrodie）×NHM（C.lanatus var.lanatus）〕×PI386015（C.colocynthis）構建的圖譜中發(fā)現(xiàn)AFLP 標記與 RAPD、ISSR、SSR相比，表現(xiàn)出較高的偏分離比率。易克等（2004）在用重組自交系群體（PI296341×97103）構建圖譜時，AFLP標記中有30%出現(xiàn)偏分離；28%的RAPD 和ISSR 標記表現(xiàn)出偏分離；而 SSR 標記的偏分離比率為 14.8%。本試驗中278個CAPS標記的偏分離比率為20.9%，低于以上研究中AFLP、RAPD、ISSR的偏分離比率，高于SSR 標記的偏分離比率。雖然發(fā)生偏分離的標記在11個連鎖群上均有分布，但2號連鎖群上較多，27個標記中有20個標記發(fā)生了偏分離，發(fā)生偏分離的標記集中在標記WCI02-52和WCI02-38區(qū)域之間，且這些標記全都偏向于母本，推測該區(qū)域存在與糖含量相關的QTL位點。QTL分析結果證實了這一推測，在標記偏分離區(qū)域找到了3個與糖含量相關的QTL位點，且這3個位點均表現(xiàn)為母本基因型。

3.3果實糖含量的QTL 分析

國內(nèi)外關于西瓜可溶性糖含量基因定位的報道很少，Ren等（2014）對已經(jīng)發(fā)表的4個遺傳連鎖圖譜進行整合時，除了對已經(jīng)發(fā)表的與西瓜果實和種子相關的12個性狀進行了重新定位，又加入了果實可溶性糖含量相關性狀的QTL分析。定位到與可溶性固形物含量相關的位點4個，分別分布在2號（2個）、6號（1個）和8號（1個）連鎖群上。本試驗在2號連鎖群上也定位到2個與可溶性固形物相關的QTL，在6號、9號連鎖群上各定位到了1個，但并未在8號連鎖群上定位到控制可溶性固形物含量的位點。Ren等（2014）定位到5個與果糖相關的QTL，分別位于2號（2個）、3號（1個）、6號（1個）、8號（1個）連鎖群上，本試驗定位到3個果糖的QTL，分別位于2、6、7號連鎖群上，沒有在3號和8號連鎖群上找到位點。本試驗只定位到了1個葡萄糖相關的QTL，位于6號連鎖群上，結果與Ren等（2014）相同。Ren等（2014）定位到蔗糖相關的QTL 3個，分別分布在2號（2個）和5號（1個）連鎖群上。本試驗定位到1個蔗糖QTL，位于9號連鎖群上。綜合Ren等（2014）和本試驗的研究結果可以推斷，2號和6號連鎖群上存在與糖含量相關的基因。

另外，在Ren等（2014）的試驗和本試驗中均發(fā)現(xiàn)QTL重合現(xiàn)象，在Ren等（2014）的研究中，2號連鎖群上控制可溶性固形物的QTL與葡萄糖和蔗糖的QTL發(fā)生重合，6號連鎖群上果糖與葡萄糖的QTL也存在同一定位，本試驗中6號連鎖群WCI06-39和WCI06-53標記之間可溶性固形物、果糖、葡萄糖之間存在同一定位。表明這4個性狀之間確實存在極顯著的相關關系?？刂铺呛康脑S多 QTL 都在同一個連鎖群上聚集，可能是基因連鎖或多效基因的結果。果實糖含量是容易受環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀，本試驗結果還需要進行多年多點的試驗加以驗證。

本試驗利用花園母本×LSW-177雜交配制的含有125個單株的RILs群體，構建了1張CAPS遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含245個CAPS標記，分布在11個連鎖群上，覆蓋基因組長度2 423.9cm，標記間的平均距離9.9cm，獲得與果實糖含量相關的QTL位點9個，其中可溶性固形物相關的QTL 4個（BRX2-1、BRX2-2、BRX6-1 、BRX9-1），果糖3個（Fru2-1、Fru6-1 、Fru7-1）、蔗糖（Suc9-1）和葡萄糖（Glu6-1）各1個，這9個QTL對果實糖含量均表現(xiàn)為正的加性效應。

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QTL Analysis for Sugar Content Related Traits in Watermelon

CHENG Yao，LIU Shi， ZHU Zi-cheng， LUAN Fei-shi*
〔Horticulture College， Northeast Agricultural University，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（Northeast region）， Ministry of Agriculture， Harbin 150030，Heilongjiang，China〕

Abstract：A recombinant inbred lines（RILs）of 125 F2S7progenies were derived from the cross， a watermelon line ‘Huayuanmuben’ with high sugar content as female parent， and a watermelon line ‘LSW-177’ with low sugar content as male parent.A genetic linkage map was constructed by using cleavage amplified polymorphic sequence（CAPS）markers.The map contained 245 CAPS markers and grouped into 11 linkage groups，spanning a total length of 2 423.9cm， with an average gap of 9.9cm between each marker.A quantitative trait locus（QTL）analysis was conducted by using composite interval mapping method（CIM）to locate fruit sugar content locus.A total of 4 QTLs related to soluble solids content were identified， showing 14.80%， 11.50%，32.10% and 8.60% phenotypic variances， respectively.3 QTLs related to fruit fructose content were identified，showing 8.80%，20.50% and 9.50% phenotypic variances， respectively.One QTL related to fruit sucrose and 1 QTL related to glucose content were identified， showing 11.34% and 24.10% phenotypic variances， respectively.These 9 QTLs showed a positive additive effect for sugar content means cultivar ‘Huayuanmuben’ contributed the favorable alleles.

Key words：Watermelon；CAPS；Genetic linkage map；Sugar content；QTL

基金項目：農(nóng)業(yè)部“948”計劃項目（2014-S15），國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術體系-分子育種崗位項目（CARS-26-02）

收稿日期：2015-02-06；接受日期：2015-04-07

*通訊作者（

Corresponding author）：欒非時，女，教授，博士生導師，專業(yè)方向：西甜瓜分子遺傳育種，E-mail：luanfeishi@sina.com