王立浩 張正海 毛勝利 曹亞從 堵玫珍 張寶璽

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

?

甜椒抗番茄斑點萎蔫病毒的種質創(chuàng)新

王立浩 張正海 毛勝利 曹亞從 堵玫珍 張寶璽*

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

摘 要：番茄斑點萎蔫病毒病是我國辣椒生產(chǎn)的一種新興和潛在重大威脅病害。利用引進的中國辣椒（Capsicum chinense Jack.）抗源材料PI152225，通過種間雜交和分子標記輔助回交選育，歷時10年，將抗性基因Tsw轉育到中椒系列骨干親本一年生辣椒（Capsicum annuum L.）大果甜椒自交系0516中，創(chuàng)新材料0516（Tsw）的生長勢和果實長度超過對照0516，商品性和配合力與骨干親本0516差異不顯著。

關鍵詞：辣椒；番茄斑點萎蔫病毒；種間雜交；分子標記輔助育種

王立浩，副研究員，專業(yè)方向：辣椒遺傳育種，E-mail：wanglihao@ caas.cn

致謝：感謝法國農業(yè)科學院Benoit Moury 博士幫助進行人工接種抗病性鑒定

番茄斑點萎蔫病毒（TSWV）是我國辣椒生產(chǎn)的重大潛在病害。該病毒在世界上廣泛分布，是北美、歐洲等地辣椒生產(chǎn)的首要病毒，巴西（Boiteux et al.， 1993a）、美國（Hobbs et al.，1994）、意大利（Roggero et al.， 2002）、澳大利亞（Sharman & Persley， 2006）、韓國（Mun et al.， 2008）相繼報道，給辣椒生產(chǎn)帶來巨大損失，嚴重的時候可以造成絕收。我國近年來也有云南辣椒上發(fā)現(xiàn)了番茄斑點萎蔫病毒的報道（佟愛仔，2012）。番茄斑點萎蔫病毒是由薊馬專型傳播的一種病毒病，我國在2000年前后首次發(fā)現(xiàn)西花薊馬（王立浩，2003；張友軍等，2003），之后西花薊馬在全國范圍內流行，目前在廣東、海南、云南露地，以及北方的山東、北京等地溫室危害嚴重。隨著西花薊馬的流行傳播，番茄斑點萎蔫病毒對辣椒的危害有加重的趨勢。據(jù)中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所辣椒課題組對北京地區(qū)病毒病的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在近5年來至少有兩年辣椒上暴發(fā)過番茄斑點萎蔫病毒，并進行了ELISA（酶聯(lián)免疫）鑒定（待發(fā)表）。

辣椒中TSWV的抗源材料并不豐富，一年生辣椒（Capsicum annuum L.）缺乏抗病毒資源。Boiteux等（1993b）鑒定了70份不同種辣椒材料，僅從2份C.chinense Jack.（中國辣椒）材料中鑒定出具有過敏性反應的顯性單基因抗性。Black等（1996）稱PI152225（C.chinense）和PI159236（C.chinense）中TSWV抗性是由同一個基因 Tsw控制的。Moury等（2000）開發(fā)了1個與PI152225中抗性基因Tsw緊密連鎖的CAPS標記，可以應用到輔助育種中?；?Tsw是辣椒中已知的唯一一個抗番茄斑點萎蔫病毒基因，Hoang等（2013）鑒定出1份新的抗源材料AC09-207（C.chinense），由單顯性基因控制，抗病基因是否是Tsw還不確定。

目前國內外抗番茄斑點萎蔫病毒的甜辣椒自交系和品種還未見報道。根據(jù)對其發(fā)病規(guī)律的認識，本課題組前瞻性地提出了種質創(chuàng)新計劃。由于缺乏抗病資源，在本研究開始之初，病原沒有被分離，且抗病接種鑒定在國內存在困難，因此TSWV的抗性育種具有很大困難。

1　材料與方法

1.1試驗材料

甜椒0516（C.annuum L.）為本課題組選育的大果自交系，群體整齊，綜合性狀優(yōu)良，具有較高的配合力，是中椒系列的骨干親本，但對番茄斑點萎蔫病毒敏感。PI152225屬于中國辣椒（C.chinense），2003年由法國農業(yè)科學院Alain Palloix博士提供，群體整齊，分枝性強，果實小（橫徑1.6cm，縱徑4.0cm），含有Tsw基因，高抗番茄斑點萎蔫病毒（人工接種抗性鑒定表現(xiàn)免疫），但在我國北方地區(qū)種植時植株結果性差，同一年生辣椒雜交親和性低。將PI152225作為抗番茄斑點萎蔫病毒的辣椒抗源材料。

1.2種間雜交和整體種質創(chuàng)新過程

自2007年開始，利用2份材料進行種間雜交，以0516為母本，以PI152225為父本，獲得F1。繼而利用0516為回交親本進行回交，利用CAPS分子標記進行回交后代的選擇（Moury et al.，2000），同時進行園藝性狀的選擇。經(jīng)過5代回交和3代自交獲得材料12P80，命名為“0516（Tsw）”。測定各個育種世代的果實大小和單果質量。在法國農業(yè)科學院進行回交5代和育成自交系的番茄斑點萎蔫病毒人工接種抗性鑒定。從2013年開始試配組合，進行配合力測試和番茄斑點萎蔫病毒人工接種抗性鑒定，篩選出優(yōu)良組合進行品種比較試驗，小區(qū)面積4.7 m2，隨機區(qū)組設計，3次重復。利用Excel軟件進行方差分析。

1.3分子標記輔助選擇

基因組DNA的提取與檢測：提取回交后代及自交分離群體單株的DNA，用于檢測供篩選分子標記的多態(tài)性。采用改良的CTAB小量法提取辣椒基因組DNA（Fulton et al.，1995）。用Biospec-nano微量分光光度計檢測所提DNA質量和濃度，將DNA稀釋至50 ng·μL-1備用。種間雜交和分子標記輔助選擇的育種技術體系：在回交和自交基因分離世代（圖1），以單株DNA為樣本，進行CAPS標記檢測，PCR反應體系參見Moury等（2000）。PCR產(chǎn)物的檢測：取3μL PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，或用1.5%瓊脂糖凝膠檢測。

圖1　0516（Tsw）的回交轉育系譜圖MAS：分子標記輔助選擇。

1.4番茄斑點萎蔫病毒抗性鑒定

2014年將自交系和配制組合在法國農業(yè)科學院Benoit Moury博士實驗室進行TSW病毒人工接種抗性鑒定。TSW病毒采用普遍流行株系。鑒定方法參考Moury等（2000）。每個材料接種30株，接種21 d后進行調查。

2　結果與分析

2.1種質創(chuàng)新過程和果實性狀

自交系PI152225和自交系0516雜交親和力低，產(chǎn)籽率低，僅獲得少數(shù)幾粒飽滿種子。對回交世代進行SCAR分子標記選擇（圖2）和園藝性狀的選擇。分析選育過程中的果實大小和單果質量（圖3、4）。在回交1代至3代，果實大小和單果質量緩慢增加，至回交4代和5代，果實的大小和單果質量快速提高，但方差較大，說明群體內基因尚未純化。經(jīng)過2代自交之后，果實大小基本穩(wěn)定到回交親本水平，方差變小，材料趨于純和（圖5～8）。

圖2　CAPS標記分子標記輔助選擇回交世代（BC2）的圖譜M，DNA Marker；S，Tswv感病連鎖標記單株；R，Tswv抗病連鎖標記單株；*，缺失數(shù)據(jù)；1.5%瓊脂糖凝膠，EB染色。

2.2創(chuàng)新材料的植物學特點

創(chuàng)新材料0516（Tsw）花期節(jié)位整齊，平均單果質量與輪回親本相比有所提高，但差異不顯著；果實縱徑較輪回親本增長15.7%，差異顯著；植株生長勢得到顯著提高（圖9、10，表1）。

2.3創(chuàng)新材料的配合力

分別利用0516（Tsw）、0516作父本，與甜椒自交系77013雜交進行F1產(chǎn)量比較（77013×0516即目前的主栽品種中椒105號）。2013～2014年77013×0516（Tsw）平均產(chǎn)量3 900.5kg·（667 m2）-1，比對照中椒105號增產(chǎn)8.27%；77013×0516（Tsw）單果質量為101 g，對照為107 g。創(chuàng)新材料的植株長勢強，果實商品性和果實大小優(yōu)于中椒105號。

2.4創(chuàng)新材料和配制組合對番茄斑點萎蔫病毒的抗性

2012年本所農場大棚辣椒發(fā)生病毒病，其中PI152225和轉育中的0516（Tsw）〔BC5（0516×PI152225）S2〕表現(xiàn)抗病，其余材料（包括0516）均表現(xiàn)感病，經(jīng)鑒定該病毒為番茄斑點萎蔫病毒（圖11、12）。2014年委托法國農業(yè)科學院進行番茄斑點萎蔫病毒人工接種抗性鑒定，0516（Tsw）和 77013×0516（Tsw）均表現(xiàn)抗病，0516和中椒105（77013×0516）均表現(xiàn)感?。ū?，圖13）。

圖3　選育過程中果實長度和寬度的群體變化

圖4　選育過程中單果質量的群體變化

表1　轉育自交系與回交親本的植株性狀

表2　人工接種鑒定番茄斑點萎蔫病毒鑒定結果

3　結論與討論

本研究的甜椒資源創(chuàng)新實現(xiàn)了分子標記輔助育種同常規(guī)育種的結合，是分子標記輔助育種的一個應用實例。通過分子標記輔助育種，在回交5代過程中，準確地選擇含有抗病基因的材料，省去了中間轉育世代人工接種抗性鑒定，避免了通過表觀性狀選擇可能出現(xiàn)的失誤。在回交世代中，由于采用了分子標記輔助選擇，在田間選擇過程中可以更多關注其他園藝性狀的選擇，加快了材料園藝性狀優(yōu)化的速度。試驗結果表明，回交4代的群體果實大小已經(jīng)接近回交親本。目前已利用創(chuàng)新材料0516（Tsw）配制了多個組合。

到目前為止，辣椒中僅在中國辣椒中發(fā)現(xiàn)了Tsw這一個單基因的番茄斑點萎蔫病毒抗性基因。本文是利用種間雜交獲得的抗番茄斑點萎蔫病毒甜椒自交系?？狗寻唿c萎蔫病毒甜椒自交系的育成將對我國該病毒的防治起到重要作用。不斷鑒定篩選新的抗源基因是實現(xiàn)抗病資源創(chuàng)新和新品種選育所需要的。番茄斑點萎蔫病毒的變異可能克服該抗病基因（Tsw），這將會給育種工作帶來新的挑戰(zhàn)。

圖5　BC1（0516×PI152225）的群體果實

圖6　BC5（0516×PI152225）S2的群體果實

圖7　抗源材料PI152225（C.chinense）

圖8　自交系0516果實和轉育自交系0516（Tsw）的果實

圖9　自交系0516

圖10　自交系0516（Tsw）

圖11　番茄斑點萎蔫病毒（TSWV）侵染辣椒果實癥狀（2012年本所農場大棚）

圖12　田間普遍發(fā)生番茄斑點萎蔫病毒（TSWV）時各材料的抗病情況（2012年本所農場大棚）a，抗源材料PI152225，抗?。籦，甜椒自交系0516，感病；c，甜椒自交系BC5（0516×PI152225）S2，抗?。籨，其他28份甜椒材料，感病。

跋：有感《中國蔬菜》2010年第1期卷首“一位98歲老人的心愿”，謹以此文向李鵬飛教授致敬！

圖13　TSWV人工接種抗病性鑒定結果a，中椒105號；b，0516；c，0516（Tsw）；d， 77013×0516（Tsw）。

參考文獻

佟愛仔，趙興能，孔寶華，陳海如，蔡紅.2012.侵染云南煙草的番茄斑萎病毒（TSWV）的RT-PCR檢測.云南農業(yè)大學學報，（6）：809-813.

王立浩.2003.外來入侵害蟲——西花薊馬在北京等地辣椒上的暴發(fā).中國蔬菜，（5）：7.

張友軍，吳青軍，徐寶云，朱國仁.2003.危險性外來入侵生物——西花薊馬在北京發(fā)生危害.植物保護，29（4）：58-59 Black L L，Hobbs H A，Gatti J M.1996.Tomato spotted wilt virus resistance in Capsicum chinense PI152225 and 159236.Plant Disease，75：863.

Boiteux L S，Nagata T，Dusi A N，de ávila A C.1993a.Natural occurrence of two Tosporivus species infecting Capsicum spp.in Brazil.Capsicum & Eggplant Newsletter，12：75.

Boiteux L S， Nagata T， Dutra W P N，F(xiàn)onseca M E.1993b.Sources of resistance to Tomato spotted wilt virus（TSWV）in cultivated and wild species of Capsicum.Euphytica， 67（1）：89-94.

Fulton T M，Chunwongse J，Tanksley S D.1995.Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants.Plant Molecular Biology Reporter，13：207-209.

Hoang N H ， Yang H B， Cheorl K.2013.Identification and inheritance of a new source of resistance against Tomato spotted wilt virus（TSWV）in Capsicum.Scientia Horticulturae， 161：8-14.

Hobbs H A， Black L L， Johnson R R， Valverde V A.1994.Differences in reactions among Tomato spotted wilt virus isolates to three resistant Capsicum chinense lines.Plant Dis，78：1220.

Moury B， Pflieger S， Blattes A， Lefebvre V， Palloix A.2000.A CAPS marker to assist selection of Tomato spotted wilt virus（TSWV）resistance in pepper.Genome， 43（1）：137-142.

Mun H Y， Park M R， Lee H B， Kim K H.2008.Outbreak of Cucumber mosaic virus and Tomato spotted wilt virus on bell pepper grow in Jeonnam in Korea.Plant Pathol J，24（1）：93-96.

Roggero P， Masenga V， Tavella L.2002.Field isolates of Tomato spotted wilt virus overcoming resistance in pepper and their spread to other hosts in Italy.Plant disease， 86（9）：950-954.

Sharman M， Persley D M.2006.Field isolates of Tomato spotted wilt virus overcoming resistance in Capsicum in Australia.Australasian Plant Pathology， 35（2）：123-128.

Innovation of Sweet Pepper（Capsicum annuum L.）Germplasm Resource with Resistance to Tomato spots wilt virus

WANG Li-hao，ZHANG Zheng-hai，MAO Sheng-li，CAO Ya-cong，DU Mei-zhen，ZHANG Bao-xi*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：Tomato spots wilt virus is a serious disease affecting pepper production in China.It is also a new and high potential threat to pepper production.Using resistant material PI152225 of imported pepper（Capsicum chinense Jack.），this study has conducted backcross via interspecies crossing and molecular markers assisted breeding for 10 years，and successfully introduced the resistant gene Tsw into the inbred line 0516 of sweet pepper（Capsicum annuum L.）with large fruit.The growth vigor and fruit length of this innovated material 0516（Tsw）has surpassed that of the contrast.There were no significant differences in their commodity nature and coordinate ability.

Key words：Pepper；Tomato spots wilt virus；Interspecies crossing；Molecular markers assisted breeding

基金項目：國家“863”計劃項目（2012AA100103002），農科院創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），農業(yè)部大宗蔬菜體系項目（CARS-25），公益研究所基金項目（ICS，CAAS）（1610032011011）

收稿日期：2015-12-23；接受日期：2016-01-12

*通訊作者（

Corresponding author）：張寶璽，研究員，專業(yè)方向：遺傳育種，E-mail：zhangbaoxi@caas.cn