袁建清，李志剛，黃櫻，王祥云，汪玲紅，廖春英

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000)

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七氟烷預處理對缺血性腦損傷小鼠神經(jīng)保護作用及與TREK-1通道的關(guān)系

袁建清，李志剛，黃櫻，王祥云，汪玲紅，廖春英

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000)

目的 觀察七氟烷預處理對缺血性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護作用，并探討TREK-1通道與其保護作用的關(guān)系。方法 將野生型小鼠隨機分為實驗1組、對照1組和假手術(shù)1組，TREK-1基因敲除型小鼠隨機分為實驗2組、對照2組和假手術(shù)2組，各12只。實驗組吸入最小肺泡濃度七氟烷，對照組和假手術(shù)組吸入100%空氣，均30 min/次，1次/d，連續(xù)處理4 d。實驗組、對照組采用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組僅分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈。用雙盲法對神經(jīng)功能缺損程度進行評分；將小鼠處死取腦組織，用TTC染色法測定腦梗死面積；用免疫熒光法檢測腦組織中TREK-1表達；用TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡。結(jié)果 野生型小鼠腦片可見TREK-1大量、廣泛地表達于其海馬、皮層、腦室旁，而TREK-1基因敲除型小鼠腦片未見明顯TREK-1表達。造模后24 h，實驗1組神經(jīng)功能缺損程度評分、腦梗死面積、腦組織凋亡細胞百分比低于對照1組、實驗2組(P均<0.05)，實驗2組以上指標與對照2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結(jié)論 七氟烷預處理對缺血性腦損傷小鼠有神經(jīng)保護作用，TREK-1通道參與該作用過程。

缺血性腦損傷；TREK-1通道；七氟烷；小鼠

七氟烷是一種臨床常用的揮發(fā)性麻醉藥。近期有研究表明，七氟烷預處理在小鼠腦缺血中具有神經(jīng)保護作用，但其作用機制目前尚未完全明確[1]。TREK-1通道是一種新型的雙孔鉀離子通道亞型，可被機械牽張、多聚不飽和脂肪酸和一些揮發(fā)性麻醉藥如氟烷、七氟烷、乙醚等激活。TREK-1通道開放后，介導線性I-V關(guān)系的背景K電流和低的膜電位，有助于調(diào)控水及離子動態(tài)平衡、清除興奮性毒性物質(zhì)及氧自由基，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[2]。2016年1月筆者通過七氟烷預處理TREK-1基因敲除型和野生型小鼠，觀察七氟烷預處理對小鼠缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用，并探討TREK-1通道與該保護作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物、材料及儀器 健康雄性8周齡野生型和TREK-1基因敲除型C57 BL/6J小鼠各36只，體質(zhì)量21～29 g，由贛南醫(yī)學院動物實驗中心提供。七氟烷(美國Baxter公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美國Sigma公司)，兔抗TREK-1(以色列Alomone Labs公司)，TUNEL試劑盒(美國Milipore公司)，花青素(Cy3)標記的驢抗兔IgG、普通小牛血清、普通羊血清和普通驢血清(美國Jackson ImmunoResearch公司)。CM1900型恒冷切片機(德國Leica公司)，F(xiàn)V500型激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 動物分組及預處理 將野生型小鼠隨機分為實驗1組、對照1組和假手術(shù)1組各12只，TREK-1基因敲除型小鼠隨機分為實驗2組、對照2組和假手術(shù)2組各12只。實驗組行七氟烷預處理，將小鼠放入麻醉呼吸箱(Drager公司)中，保持其清醒呼吸狀態(tài)，吸入最小肺泡濃度七氟烷(2.4%七氟烷/空氣)；對照組和假手術(shù)組吸入100%空氣。均30 min/次，1次/d，連續(xù)處理4 d。預處理結(jié)束后24 h，進行局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型制備。預處理期間監(jiān)測各組生理指標(pH、PaCO2、PaO2)，維持肛溫(37±0.5)℃。

1.3 MCAO模型制備 應用線栓法建立MCAO模型[3]。各組均用6%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)，術(shù)中維持動物直腸溫度(36.6±0.5)℃。分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈。實驗組和對照組小鼠于頸總動脈近頸內(nèi)動脈、頸外動脈分叉處剪一小口，將一直徑0.3 mm、前端5 mm處涂硅膠的尼龍魚線插入頸內(nèi)動脈，距頸總動脈分叉處1.8～2.0 cm，1 h后全部拔出絲線進行再灌注，假手術(shù)組除不插線栓外余步驟同上。術(shù)后各組于20 ℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由進水、進食。

1.4 各組神經(jīng)功能缺損程度評分 造模后24 h，通過雙盲法進行神經(jīng)功能缺損程度評分，評分標準[4]：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸直右側(cè)前爪；2分，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向右側(cè)傾倒；4分，無自動活動伴有意識障礙；5分，死亡。

1.5 小鼠腦梗死面積測定 采用TTC染色法。造模后24 h，各組隨機取6只小鼠，斷頭取腦，自視交叉前4 mm開始連續(xù)冠狀面冰凍切片(2 mm厚)。共取6片切片，置于2% TTC中染色，37 ℃避光孵育20 min，存活組織深紅，壞死組織呈白色，數(shù)碼相機(DSC-T300，SONY)拍照，輸入計算機，用Image Tool圖像處理軟件進行不顯色部分面積分析，并計算梗死面積，梗死面積=(∑缺血對側(cè)面積×2 mm-∑缺血同側(cè)未梗死面積×2 mm)/(∑對側(cè)面積×2 mm)×100%[5,6]。

1.6 小鼠腦組織中TREK-1表達檢測 采用免疫熒光法。造模后3 d，各組各取剩余6只小鼠快速斷頭取腦，將腦組織置于-80 ℃冷凍保存。-20 ℃恒冷切片機自視交叉處開始，行10 μm厚連續(xù)冠狀切片。冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4 ℃)固定15 min，PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驢血清封閉液封閉2 h，棄血清，滴加兔抗TREK-1(1∶200)，對照組不加一抗，4 ℃孵育過夜；PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加驢抗兔Cy3(1∶200)，室溫避光孵育1 h，流水沖洗40 min，50%甘油封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)/發(fā)射波長為550/565 nm的CY3呈紅色熒光，表示TREK-1蛋白陽性。

1.7 小鼠腦組織細胞凋亡檢測 采用TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡。TUNEL染色嚴格按照TUNEL試劑盒說明書進行操作，加DAPI復染細胞核。Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，TUNEL陽性細胞即為凋亡細胞。每張片子隨機取5個視野，同一曝光條件下照相，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組造模前后神經(jīng)功能缺損程度評分比較 造模前各組小鼠神經(jīng)功能缺損程度評分為0分。造模后24 h，實驗1組、對照1組、假手術(shù)1組神經(jīng)功能缺損程度評分分別為(1.5±0.5)、(3.5±0.7)、0分，實驗2組、對照2組、假手術(shù)2組分別為(3.0±0.7)、(3.5±0.8)、0分；實驗1組評分低于對照1組、實驗2組(P均<0.05)，實驗2組評分與對照2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組腦梗死面積比較 造模后24 h，實驗1組、對照1組、假手術(shù)1組腦梗死面積分別為(16.58±5.88)%、(31.98±10.14)%、0，實驗2組、對照2組、假手術(shù)2組分別為(25.12±8.91)%、(32.30±10.24)%、0；實驗1組腦梗死面積少于對照1組、實驗2組(P均<0.05)，實驗2組腦梗死面積與對照2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 各組腦組織中TREK-1表達比較 野生型小鼠腦片可見TREK-1大量、廣泛地表達于其海馬、皮層、腦室旁，而TREK-1基因敲除小鼠腦片未見明顯TREK-1表達。

2.4 各組腦組織細胞凋亡比較 造模后3 d，假手術(shù)1組、實驗1組、對照1組凋亡細胞百分比分別為(1.27±0.25)%、(9.90±1.68)%、(31.75±2.90)%，假手術(shù)2組、實驗2組、對照2組分別為(1.40±0.28)%、(30.22±3.37)%、(33.27±3.02)%；實驗1組TUNEL陽性細胞百分比低于對照1組、實驗2組(P均<0.05)，實驗2組TUNEL陽性細胞百分比與對照2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

缺血性腦損傷是一種致死率、致殘率極高的多發(fā)病、常見病，且易再發(fā)和復發(fā)，嚴重危害人類身心健康，并帶來巨大的經(jīng)濟負擔。探討治療缺血性腦損傷的有效措施和藥物，是近年來醫(yī)學研究的一大熱點[7]。七氟烷是臨床上常用的一種揮發(fā)性麻醉藥，可增加腦血流量，降低腦的氧代謝率[8]。近期有研究表明，吸入性麻醉藥七氟烷在腦缺血中具有神經(jīng)保護作用[9～11]。但其作用的具體機制尚不清楚，可能對腦血流量、腦代謝、炎癥因子及其相關(guān)信號傳導產(chǎn)生一定影響[12]。有研究認為，七氟烷可減少核因子κB入核，降低其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的炎癥因子如環(huán)氧化酶2、誘導型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子α、白細胞介素1(IL-1)、IL-6等來抑制炎癥反應[13]；激活KATP通道，抑制缺血期神經(jīng)元的鈣離子和興奮性氨基酸濃度的升高[12]；抑制腦缺血后的細胞凋亡[1,14]，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。國外通過細胞培養(yǎng)離體研究表明，雙孔鉀通道TREK-1參與了七氟烷預處理在腦缺血中的神經(jīng)保護作用。TREK-1通道是一種新型的雙孔鉀離子通道亞型，可被機械牽張、多聚不飽和脂肪酸、溶血磷脂和一些揮發(fā)性麻醉藥如氟烷、七氟烷、乙醚、氙氣等激活[15]。TREK-1廣泛表達于大鼠海馬、皮層，其活性可影響腦缺血時星形膠質(zhì)細胞的增殖活化以及平衡緩沖功能[16,17]。TREK-1通道開放后，表達具有線性I-V關(guān)系的背景鉀電流，在細胞膜靜息電位的形成和膜電位的復極化中起重要作用。其能穩(wěn)定膜電位，調(diào)節(jié)細胞的興奮性，使細胞膜超極化，減少鈣離子內(nèi)流，降低谷氨酸的轉(zhuǎn)運和興奮性細胞毒性[2,15]。

本研究通過七氟烷預處理TREK-1基因敲除型和野生型小鼠后，建立MCAO，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，七氟烷可減輕野生型小鼠MCAO后的神經(jīng)功能缺損程度，減少腦梗死面積，抑制腦缺血后的細胞凋亡，但七氟烷預處理TREK-1基因敲除型后，則無以上作用。證實了七氟烷預處理對小鼠腦缺血后有神經(jīng)保護作用，且TREK-1通道參與了該保護作用，并推測這可能與七氟烷開放TREK-1通道，使細胞膜電位超極化，細胞興奮性降低，減少興奮性毒性損傷，從而減少神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。為進一步研究其作用機制提供實驗基礎。

[1] Codaccioni JL, Velly LJ, Moubarik C, et al. Sevoflurane preconditioning against focal cerebral ischemia: inhibition of apoptosis in the face of transient improvement of neurological outcome[J]. Anesthesiology, 2009,110(6):1271-1278.

[2] 袁建清,謝敏杰,王偉.雙孔鉀離子通道結(jié)構(gòu)以及在鼠類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達和功能[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2010,5(1):56-59.

[3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[4] Kitano H, Young JM, Cheng J, et al. Gender-specific response to isoflurane preconditioning in focal cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2007,27(7):1337-1386.

[5] Xing B, Chen H, Zhang M, et al. Ischemic Postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat[J]. Stroke, 2008,39(8):2362-2369.

[6] Swanson RA, Morton MT, Tsao-Wu G, et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1990,10(2):290-293.

[7] Puyal J, Ginet V, Clarke PG. Multiple interacting cell death mechanisms in the mediation of excitotoxicity and ischemic brain damage: a challenge for neuroprotection[J]. Prog Neurobiol, 2013,105(6):24-48.

[8] Oshima T, Karasawa F, Okazaki Y, et al. Effects of sevoflurance on cerebral blood flow and cerebral metabolic rate of oxygen in human beings: a comparison with isoflurane[J]. Eur J Anaesthesiol, 2003,20(7):543-547.

[9] Sakai H, Sheng H, Yates RB, et al. Isoflurane provides long-term protection against focal cerebral ischemia in the rat[J]. Anesthesiology, 2007,106(1):92-99.

[10] Payne RS, Akca O, Roewer N, et al. Sevoflurane-induced preconditioning protects against cerebral ischemic neuronal damage in rats[J]. Brain Res, 2005,1034(1-2):147-152.

[11] Luo Y, Ma D, Ieong E, et al. Xenon and sevoflurane protect against brain injury in a neonatal asphyxia model[J]. Anesthesiology, 2008,109(5):782-789.

[12] 施宏,余瓊,王海蓮,等.七氟烷預處理神經(jīng)保護機制的研究進展[J].國際麻醉學與復蘇雜志,2011,32(1):117-120.

[13] Lee HT, Kim M, Kim N, et al. Isoflurane protects against renal ischemia and reperfusion injury and modulates leukocyte infiltration in mice[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007,293(3):F713-F722.

[14] Pape M, Engelhard K, Eberspacher E, et al. The long-term effect of sevoflurane on neuronal cell damage and expression of apoptotic factors after cerebral ischemia and reperfusion in rats[J]. Anesth Analg, 2006,103(1):173-179.

[15] Franks NP, Honore E. The TREK K2P channels and their role in general anaesthesia and neuroprotection[J]. Trends Pharmacol Sci, 2004,25(11):601-608.

[16] 袁建清,廖春英,黃櫻.大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)TREK-1、GFAP表達變化[J].山東醫(yī)藥,2015,55(45):40-42.

[17] Wang M, Song J, Xiao W, et al. Changes in lipid-sensitive two-pore domain potassium channel TREK-1 expression and its involvement in astrogliosis following cerebral ischemia in rats[J]. J Mol Neurosci, 2012,46(2):384-392.

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目(20165343)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.009

R743.31

A

1002-266X(2016)37-0028-03

2016-06-24)