郭明日，張麗霞，周洪經(jīng)，李玉明，孫海柏，張立

(1天津市海河醫(yī)院，天津300350；2天津市呼吸疾病研究所；3國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點(diǎn)研究室)

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Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

郭明日1,2,3，張麗霞1,2，周洪經(jīng)1,2，李玉明1,2，孫海柏1,2，張立1,2

(1天津市海河醫(yī)院，天津300350；2天津市呼吸疾病研究所；3國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點(diǎn)研究室)

目的 探討Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選擇180例受試者，其中肺結(jié)核98例、肺外結(jié)核35例及非結(jié)核病47例。所取受試者痰、支氣管灌洗液、腦脊液等標(biāo)本分別采用Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)，用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)評(píng)價(jià)各檢測(cè)方法的診斷效能，采用Kappa檢驗(yàn)分析Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)的一致性。結(jié)果 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB對(duì)肺結(jié)核與肺外結(jié)核檢測(cè)的陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960單獨(dú)檢測(cè)及二者聯(lián)合檢測(cè)(P均<0.05)。T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的AUC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但均大于Xpert MTB/RIF、MGIT 960、Xpert MTB/RIF+MGIT960的AUC(P均<0.05)。Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)具有較高的一致性(κ=0.735)。結(jié)論 T-SPOT·TB檢測(cè)、T-SPOT·TB聯(lián)合MGIT960檢測(cè)、三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病診斷有較高價(jià)值，三者聯(lián)合檢測(cè)的價(jià)值最高。

結(jié)核?。唤Y(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥基因檢測(cè)；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)系統(tǒng)

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展為結(jié)核病的快速診斷及結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性檢測(cè)提供了新的方法。MTB/利福平耐藥基因檢測(cè)(Xpert MTB/RIF)是一種新型的MTB感染及利福平耐藥性分析的分子診斷平臺(tái)，由美國Cepheid公司研發(fā)，目前該分子診斷技術(shù)受到廣泛關(guān)注。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT·TB)是一種使用MTB特異性抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌干擾素γ(IFN-γ)的量來判斷是否存在MTB感染的免疫學(xué)技術(shù)。自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)系統(tǒng)(BACTEC MGIT960)采用熒光法原理，感應(yīng)培養(yǎng)管內(nèi)氧濃度的消耗情況來反映MTB生長狀態(tài)，可24 h連續(xù)監(jiān)測(cè)。2015年1～6月，本研究探討Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB與BACTEC MGIT960在結(jié)核病診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期住院患者180例，男111例、女69例，年齡15～86歲、平均40歲；根據(jù)《內(nèi)科學(xué)》[1]第8版診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為肺結(jié)核98例、肺外結(jié)核35例(其中結(jié)核性胸膜炎16例、胸/腰椎結(jié)核11例、淋巴結(jié)核3例、結(jié)核性腦膜炎4例，腎結(jié)核1例)、非結(jié)核病47例(肺炎25例、慢性阻塞性肺氣腫9例、胸膜炎6例、支氣管哮喘患者5例、支氣管擴(kuò)張2例)。標(biāo)本采集：痰標(biāo)本：患者清水漱口2次后打開無菌痰瓶，深吸氣用力從肺部深處咳出痰，收集于痰瓶中，擰緊瓶蓋，痰樣本保存于2～8 ℃，及時(shí)送檢。支氣管灌洗液、腦脊液、胸腹水、穿刺液標(biāo)本：按照臨床無菌操作規(guī)程進(jìn)行采集。尿液：收集24 h尿。其中痰標(biāo)本89份、支氣管灌洗液47份、腦脊液4份、胸腹水20份、膿液19份、尿液1份。支氣管灌洗液、腦脊液、胸腹水、尿液標(biāo)本檢測(cè)前以3 000 g離心20～30 min，沉淀部分加入磷酸鹽緩沖液1 mL混勻后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 Xpert MTB/RIF檢測(cè) 按每1 mL標(biāo)本加入2 mL標(biāo)本處理液，旋緊樣本盒蓋，渦旋振蕩20 s，室溫靜置15 min，取處理后樣品2 mL加入Xpert MTB/RIF反應(yīng)盒，置于檢測(cè)模塊，儀器自動(dòng)檢測(cè)，2 h后系統(tǒng)自動(dòng)判讀MTB檢測(cè)結(jié)果與利福平耐藥結(jié)果。MTB培養(yǎng)結(jié)果分為陰性和陽性，利福平檢測(cè)結(jié)果分為敏感和耐藥。

1.3 T-SPOT·TB試驗(yàn) 收集患者外周靜脈血5 mL，分離得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，洗滌后細(xì)胞計(jì)數(shù)；PBMCs和結(jié)核特異抗原早期分泌抗原靶蛋白6及培養(yǎng)濾液蛋白10同時(shí)加入預(yù)包被有IFN-γ抗體的反應(yīng)孔中，孵育過夜(37℃、5% CO2)；次日洗板，加入二抗，孵育1 h后再次洗板，加入底物顯色液孵育7 min，蒸餾水終止反應(yīng)，記錄斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFCs)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。結(jié)果判讀：陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<6時(shí)，ESAT-6或CFP-10抗原孔斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6判定為陽性；陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)，判定為陽性。

1.4 BACTEC MGIT960檢測(cè) 取菌懸液1 mL用生理鹽水4 mL稀釋，取稀釋后的菌液100 μL加入生理鹽水9.9 mL再次稀釋,取按1∶50稀釋的菌液500 μL加入1支MGIT培養(yǎng)管中混勻。取4支MGIT培養(yǎng)管，分別標(biāo)記藥物名稱，每管加入OADC營養(yǎng)添加劑500 μL，每管分別加入藥物原液100 μL、1∶5稀釋的待測(cè)菌液500 μL，連同生長對(duì)照管一起放入儀器孵育培養(yǎng)。MTB培養(yǎng)結(jié)果判讀：BACTEC MGIT960探測(cè)儀隔60 min連續(xù)自動(dòng)測(cè)定培養(yǎng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度變化，計(jì)算機(jī)分析判斷管內(nèi)MTB生長情況，出現(xiàn)陽性標(biāo)本，儀器紅色指示燈閃亮，伴提示音，取出陽性標(biāo)本經(jīng)抗酸染色為陽性的確定為MTB陽性，該陽性標(biāo)本再經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸生長試驗(yàn)、28 ℃生長試驗(yàn)、耐熱觸酶試驗(yàn)、噻吩-2-羧酸肼試驗(yàn)后判斷為MTB陽性或陰性。藥敏結(jié)果判讀：當(dāng)生長對(duì)照管為陽性時(shí)，儀器開始判讀藥敏管，并連續(xù)判讀2 d的結(jié)果。當(dāng)藥敏管在生長對(duì)照管出現(xiàn)陽性后2 d內(nèi)仍未生長則為敏感，有細(xì)菌生長則為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 三種方法單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果比較 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB對(duì)肺結(jié)核與肺外結(jié)核檢測(cè)的陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960單獨(dú)檢測(cè)及二者聯(lián)合檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。 見表1。

表1 三種方法單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果比較[例(%)]

2.2 三種方法單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核病的效能比較 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的AUC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但均大于Xpert MTB/RIF、MGIT 960、Xpert MTB/RIF+MGIT960的AUC(P均<0.05)。見表2。

表2 三種方法單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核病的AUC比較

2.3 Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)結(jié)果比較 兩種方法對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)的一致性比較采用Kappa檢驗(yàn)，κ=0.735，表明Xpert MTB/RIF和MGIT960對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)具有較高的一致性。

3 討論

Xpert MTB/RIF試驗(yàn)是WHO推薦用于檢測(cè)結(jié)核病的分子診斷平臺(tái)，是以半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)的81 bp核心區(qū)為靶序列，可在2 h內(nèi)檢出MTB和利福平的耐藥性[2]，由于利福平單藥耐藥非常少，臨床上常將利福平耐藥作為耐多藥結(jié)核病標(biāo)志物[3,4]。T-SPOT·TB是檢測(cè)血液中分泌IFN-γ、抗原特異的T淋巴細(xì)胞最為敏感的技術(shù)，很少會(huì)受到CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量少的影響。該技術(shù)對(duì)于結(jié)核病合并免疫缺陷者，仍是一種較為適宜的診斷方法[5,6]。MGIT960則是目前應(yīng)用最廣的MTB培養(yǎng)和藥敏的試驗(yàn)方法。

肺結(jié)核與肺外結(jié)核患者采用以上三種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，陽性率均高于非結(jié)核患者。肺結(jié)核與肺外結(jié)核患者經(jīng)T-SPOT·TB檢測(cè)陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT960單獨(dú)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用T-SPOT·TB、MGIT960或Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB與MGIT960聯(lián)合檢測(cè)，陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960單獨(dú)檢測(cè)及二者聯(lián)合檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以臨床診斷為參照，三種方法診斷結(jié)核病的AUC均>0.7，T-SPOT·TB與其余兩種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；診斷方法聯(lián)用后，T-SPOT·TB、MGIT960聯(lián)合診斷的AUC明顯高于MGIT960，Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB、MGIT 960聯(lián)合診斷的AUC明顯高于單用Xpert MTB/RIF或MGIT 960檢測(cè)?？赡芤?yàn)?，Xpert MTB/RIF與MGIT 960均直接檢測(cè)樣本中的MTB，因此，對(duì)于菌陰結(jié)核病患者，其檢出率將受影響，臨床可根據(jù)具體情況靈活選擇檢測(cè)方法。關(guān)于T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的價(jià)值，不同的文獻(xiàn)報(bào)道不一致。Qiu等[7]進(jìn)行的多中心、大樣本調(diào)查結(jié)果顯示，以臨床診斷為參照，T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的靈敏度和特異度分別為78.2%和91.1%。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，其靈敏度和特異度為83.3%和80.1%，且患者的年齡、性別、免疫抑制狀態(tài)、腫瘤等因素對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果均無影響[8]。Yan等[9]報(bào)道，T-SPOT·TB診斷肺結(jié)核的靈敏度高于肺外結(jié)核，診斷未經(jīng)治療結(jié)核病的靈敏度高于正在治療中活動(dòng)性結(jié)核病，故該試驗(yàn)對(duì)于結(jié)核病治療效果的評(píng)估有一定價(jià)值。此外，T-SPOT·TB亦可用于結(jié)核病與非結(jié)核病的鑒別診斷[10]。研究結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF在肺外結(jié)核病的診斷有較高價(jià)值，敏感度為0.78，特異度為0.99[11]。由于Xpert MTB/RIF可在2 h內(nèi)檢出樣本中是否有MTB及對(duì)利福平的耐藥性，因此相對(duì)于MGIT960需要數(shù)周的時(shí)間才能出具培養(yǎng)及藥敏結(jié)果優(yōu)勢(shì)非常明顯。夏輝等[12]分析了Xpert 技術(shù)在我國的應(yīng)用前景，建議將其整合入我國結(jié)核病防治規(guī)劃。

Xpert MTB/RIF可直接檢測(cè)MTB的核酸并可檢出其對(duì)利福平的耐藥性，對(duì)耐藥結(jié)核病的快速診斷有重要意義，且其操作簡易，可有效避免基因檢測(cè)污染的問題。T-SPOT·TB則是檢測(cè)MTB所分泌的ESAT-6和CFP-10所引起的T細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-γ反應(yīng)，對(duì)于早期結(jié)核病及菌陰結(jié)核病患者有較大診斷價(jià)值。BACTEC MGIT960則可對(duì)MTB進(jìn)行快速培養(yǎng)并獲得臨床一線抗結(jié)核藥物的藥敏結(jié)果。T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB對(duì)結(jié)核病的診斷效能高于其他方法，三者聯(lián)合檢測(cè)效能最高。

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天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目(2014KZ035)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.032

R52

B

1002-266X(2016)37-0093-03

2016-01-19)