尚麗元劉 蕾高雪霏

(1.吉林莫莫格國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，吉林白城 132000；2.吉林向海國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，吉林通榆 137215；3.吉林莫莫格國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，吉林白城 132000)

基于丹頂鶴和大鴇病原的分離與鑒定實(shí)驗(yàn)研究

尚麗元1劉 蕾2高雪霏3

(1.吉林莫莫格國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，吉林白城 132000；2.吉林向海國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，吉林通榆 137215；3.吉林莫莫格國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，吉林白城 132000)

本文通過對丹頂鶴和大鴇的病例剖檢，病毒、細(xì)菌的分離和培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定和16SrRNAPCR測定，實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明該死亡的丹頂鶴和大鴇因致病性大腸桿菌感染。經(jīng)過藥敏試驗(yàn)篩選得到了復(fù)方新諾明為最佳治療藥物，通過三天的飲水給藥，大群癥狀明顯得到控制。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明人工養(yǎng)殖的丹頂鶴比半散養(yǎng)的大鴇體內(nèi)分離的大腸桿菌耐藥普廣。

丹頂鶴；大鴇；病例剖檢；生化鑒定

1 試驗(yàn)方法

剖檢死亡丹頂鶴，可聞到淡淡的特殊臭味，肺臟、小腸粘膜充血出血。死亡大鴇剖檢癥狀不明顯。疑似大腸桿菌。取丹頂鶴的脾臟和肝臟等組織，低溫研磨充分，制備成1：5組織懸液，離心后取上清液，加雙抗（青霉素、鏈霉素）用0.22μm的濾膜濾過，用注射器經(jīng)尿囊腔接種9～10日齡的雞胚，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵化24h，照蛋挑出死亡的雞胚，收集死亡的雞胚放到4℃冰箱內(nèi)保存。孵化至第4d，將全部未死亡的雞胚放到4℃冰箱冷藏4h，收集尿囊液，做血凝試驗(yàn)（HA）。在無菌條件下，將丹頂鶴和大鴇的肝臟和心臟分別各劃線接種兩個(gè)加有犢牛血清的肉湯瓊脂培養(yǎng)基上。分別將兩組做好標(biāo)記。第一組培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。第二組培養(yǎng)皿放置于厭氧罐里置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)24h。分別挑取1～2個(gè)菌落接種到伊紅-美蘭培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基上，放置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h后觀察菌落的生長情況。涂片革蘭氏染色觀察，剖檢同時(shí)將丹頂鶴的心、肝和大鴇的心、肝，在無菌條件下將其新鮮切面在干凈的載玻片上壓印，自然干燥，火焰固定，革蘭氏染色。細(xì)菌純培養(yǎng)，用無菌牙簽在麥康凱培養(yǎng)基上挑取單一菌落，經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和顏色。再挑去單一菌落在麥康凱瓊脂斜面上劃線，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h后，獲得純培養(yǎng)物。然后再挑取純培養(yǎng)的單一菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中，放于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)12h。培養(yǎng)菌落的LB培養(yǎng)基和挑完菌的麥康凱瓊脂平板置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。分離菌株的16SrRNAPCR分子鑒定，在超凈臺內(nèi)挑出單個(gè)菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，放置于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)18h，此菌液作為PCR菌液的模板。將15只昆明鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，第3組為對照組。將從丹頂鶴體內(nèi)分離后純培養(yǎng)的菌株經(jīng)腹腔注射第一組小鼠；將從大鴇體內(nèi)分離后純培養(yǎng)的菌株經(jīng)腹腔注射第二組小鼠，每只小鼠腹腔注射純培養(yǎng)菌液0.1ml，對照組注射普通肉湯0.1ml，隔離詞養(yǎng)。每天觀察記錄小鼠的精神狀態(tài)，食欲和臨床癥狀和死亡情況，對死亡小鼠進(jìn)行剖檢觀察，并取小鼠肝臟等進(jìn)行細(xì)菌回歸試驗(yàn)。按Kirby-Bauer氏法，使用21種藥敏紙片對從丹頂鶴和大鴇體內(nèi)分離出的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果

接種雞胚后，孵化到第4d，結(jié)果均無死亡，收集尿囊液，經(jīng)血凝試驗(yàn)，無血凝性。雞胚的尿囊液盲傳了三代，均沒有凝血性。排除了感染禽流感病毒和新城疫病毒的可能。電子顯微鏡下未見到病毒粒子。

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

經(jīng)過不同培養(yǎng)基的分離和純化培養(yǎng)，在丹頂鶴體內(nèi)和大鴇體內(nèi)各分離一株細(xì)菌。兩株細(xì)菌在各培養(yǎng)基的生長情況相似。在血清肉湯培養(yǎng)基上呈現(xiàn)濕潤、光滑、灰白色，邊緣整齊的菌落，正常培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)下的的菌落，生長狀況均良好。在麥康凱培養(yǎng)基上呈桃紅色、濕潤、光滑、中間凸起、邊緣整齊直徑約1.5mm的菌落；在伊紅-美蘭瓊脂培養(yǎng)基上呈黑金屬光澤的圓形小菌落；三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣，斜面和底層均變黃，在液體的LB培養(yǎng)基中，呈均勻渾濁的，管底菌液有沉淀。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，革蘭氏染色，鏡檢可見到革蘭氏陰性細(xì)菌，散在或成排、兩端鈍圓，兩極濃染，無芽孢的短小桿菌見。生理生化試驗(yàn)結(jié)果，丹頂鶴源分離株可以利用麥芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、棉子糖和乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不利用山梨醇、鼠李糖和阿拉伯糖，丹頂鶴源分離株可以利用麥芽糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖和乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不利用棉子糖和阿拉伯糖，兩株菌在山梨醇、棉子糖和鼠李糖的利用有差異。

3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥性分析

丹頂鶴源和大鴇源分離出的兩株大腸桿菌有著明顯的藥敏差異，丹頂鶴源分離株對氯霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、卡那霉素高敏，對多粘菌素、阿米卡星中度敏感，其余藥品均不同程度的耐藥包括頭孢類、青霉素類、喹諾酮類、四環(huán)素類；大鴇源的大腸桿菌除了對多粘菌素、利福平、鏈霉素、四環(huán)素耐藥外，對其他藥品都有較高的敏感性。試驗(yàn)結(jié)果可以看出人工孵化的丹頂鶴體內(nèi)分離出的致病性大腸桿菌的耐藥譜遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于從半散養(yǎng)狀態(tài)下大鴇體內(nèi)分離出的大腸桿菌的耐藥譜。丹頂鶴由人工孵化，出殼后一直由人工飼養(yǎng)，出現(xiàn)拉稀、食欲不振的情況下飼養(yǎng)員通常會給與一些預(yù)防用藥而半散養(yǎng)狀態(tài)下的大鴇不曾用藥。這可能是兩株菌的耐藥性差異的原因。

4 討論

本試驗(yàn)中的丹頂鶴由人工繁育，食物基本是魚類，五月份天氣轉(zhuǎn)暖后，魚容易腐敗，雛鶴吃了不新鮮的魚易發(fā)生腹瀉，通常會給一定量的抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療。雛鶴的飼養(yǎng)環(huán)境常與游客和閑雜人接觸，也給疾病傳播創(chuàng)造了便利條件。而大鴇在圍網(wǎng)內(nèi)很少接觸到外來人員，食物也多來自于環(huán)境中的昆蟲，所以體內(nèi)的大腸桿菌的耐藥性要比丹頂鶴弱一些。避免疾病的發(fā)生最重要因素則是均衡的營養(yǎng)搭配，保證機(jī)體礦物質(zhì)元素的需求，提高自身免疫力?；\養(yǎng)鶴的某些寄生蟲性疾病、細(xì)菌性疾病的發(fā)生與飼養(yǎng)環(huán)境有著很大的關(guān)系，如住白細(xì)胞原蟲病、球蟲??；大腸桿菌、巴氏桿菌性疾病都是由條件性致病菌引起的，這些疾病的發(fā)生與通風(fēng)不良、飼養(yǎng)密度過大、排泄物清掃不及時(shí)、消毒不及時(shí)等因素有密切的關(guān)系。

[1] 陳浩，呂士成，李春榮，等.丹頂鶴疾病防治的給藥途徑與技術(shù)[J].中國家禽，2006，28（20）：34-35.