楊曉云，劉蕊，穆小燕

(1 天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2天津市人民醫(yī)院)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌效果觀察

楊曉云1，2，劉蕊2，穆小燕2

(1 天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2天津市人民醫(yī)院)

摘要：目的探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的效果。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)131例金黃色葡萄球菌感染患者送檢標(biāo)本中nuc基因和mecA基因的表達(dá)情況。nuc基因陰性且mecA基因陽(yáng)性者判定為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)，nuc基因陽(yáng)性且mecA基因陰性者判定為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)，nuc、mecA基因共同陽(yáng)性者判定為MRSA。藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果MRCNS感染25例、MSSA感染66例、MRSA感染40例。結(jié)果131例患者送檢標(biāo)本中nuc基因陽(yáng)性106例、mecA基因陽(yáng)性85例，其中MRSA 60例、MRCNS 25例、MSSA 46例。20例藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為MSSA患者的送檢標(biāo)本中檢出mecA基因，將其判定為MRSA。結(jié)論 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MRSA的效果優(yōu)于藥敏試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；nuc基因；mecA基因

耐甲氧西林金黃色葡萄球(MRSA)已成為導(dǎo)致醫(yī)院和社區(qū)感染的重要病原菌，快速、準(zhǔn)確地檢出MRSA有極其重要的臨床意義[1，2]。nuc基因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌的標(biāo)志性基因。MRSA的耐藥機(jī)制主要由mecA基因決定，此基因負(fù)責(zé)編碼特異性青霉素結(jié)合蛋白(PBP2a)，從而使MRSA對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物具有耐藥性。美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)建議，凡檢出mecA基因的金黃色葡萄球菌即可判定為MRSA[3]。2013年7月～2014年9月，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了131例金黃色葡萄球菌感染患者送檢標(biāo)本中的nuc、mecA基因表達(dá)情況，觀察其診斷MRSA的效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料納入標(biāo)本來(lái)自131例患者，其中男71例、女60例，年齡3個(gè)月～92歲。送檢科室包括ICU、兒科、外科、神經(jīng)外科、血管外科、肛腸科、骨科、婦科、泌尿科、耳鼻喉科、皮膚科。標(biāo)本類(lèi)型包括痰、鼻咽拭子、傷口或泌尿生殖道分泌物、尿液。

1.2藥敏試驗(yàn)鑒定 采用VITEK-Ⅱ全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定131例患者送檢標(biāo)本，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2013和歐洲抗菌藥敏試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)藥敏標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌類(lèi)別。用ATCC29213為敏感株。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定采用Taqman探針和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)131例患者送檢標(biāo)本金黃色葡萄球菌中nuc基因和mecA基因,操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。nuc基因陰性且mecA基因陽(yáng)性者為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)，nuc基因陽(yáng)性且mecA基因陰性者為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)，nuc、mecA基因共同陽(yáng)性者為MRSA。

2結(jié)果

131例患者送檢標(biāo)本中，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)鑒定MRCNS 25例、MSSA 66例、MRSA 40例。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)nuc基因陽(yáng)性106例，mecA基因陽(yáng)性85例；其中MRSA 60例，MRCNS 25例，MSSA 46例。20例藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為MSSA患者的送檢標(biāo)本中檢出mecA基因，將其列為MRSA。

3討論

目前，MRSA已成為國(guó)內(nèi)外院內(nèi)感染的首要致病菌，與HBV、HIV并列為世界范圍的三大難題[4~7]。MRSA 的耐藥機(jī)制主要為耐藥島，其中MRSA 對(duì)甲氧西林耐藥的編碼基因mecA位于金黃色葡萄球菌mec基因盒上，mecA基因表達(dá)的PBP2a蛋白在細(xì)菌耐藥中起關(guān)鍵作用。mecI和mecR1是一對(duì)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控mecA基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)基因，位于mecA基因的啟動(dòng)子上游。在無(wú)抗生素刺激的情況下，mecI 所編碼產(chǎn)生的mecI蛋白結(jié)合在mecA基因的啟動(dòng)子部位，使得mecA 基因表達(dá)處于抑制狀態(tài)。但是，當(dāng)環(huán)境中存在相應(yīng)抗生素(如青霉素、苯唑西林等)時(shí)，抗生素一方面攻擊正常PBPs的轉(zhuǎn)肽酶功能域，使其失去活性而喪失合成細(xì)菌細(xì)胞壁的功能，另一方面可以作為誘導(dǎo)劑，與分布在細(xì)菌胞膜上的由mecR1 基因編碼的mecR1蛋白相結(jié)合，使其發(fā)生自裂解而發(fā)揮肽酶活性，分解結(jié)合在mecA 啟動(dòng)子上的阻遏蛋白mecI,從而啟動(dòng)mecA的表達(dá)，產(chǎn)生PBP2a，代替PBP2 的轉(zhuǎn)肽酶活性，繼續(xù)金黃色葡萄球菌肽聚糖的合成，維持MRSA 耐藥性[8]。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在20例藥敏試驗(yàn)為MSSA感染者的基因中檢測(cè)到mecA 基因，并將其判定為MRSA感染，這提示實(shí)時(shí)熒光定量PCR法診斷MRSA的能力要高于藥敏試驗(yàn)。MRSA因其傳播途徑廣、致病性強(qiáng)、多重耐藥性等特點(diǎn)，成為臨床治療的難點(diǎn)[9,10]。本研究證實(shí)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可快速鑒定金黃色葡萄球菌及MRSA，檢測(cè)簡(jiǎn)便，敏感性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，能夠在疾病早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)MRSA的感染或潛在的mecA耐藥基因，為臨床合理使用抗生素提供可靠依據(jù)，防止病情惡化，有效避免院內(nèi)感染，有推廣價(jià)值。

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(收稿日期：2015-05-12)

中圖分類(lèi)號(hào)：R631

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)06-0080-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.06.031

通信作者：劉蕊(E-mail: lr3595@163.com)