黎先偉 譯 By K. Venkitanarayanan

美國養(yǎng)禽業(yè)提高家禽產品安全性的新選擇

黎先偉 譯 By K. Venkitanarayanan

前言

在美國，腸炎沙門氏菌和空場彎曲桿菌是感染人類的2種主要的食源性致病菌，這與食用生的或未煮熟的家禽產品有很大關系。而腸炎沙門氏菌是從家禽產品中分離到的最常見的沙門氏菌血清型。另一方面，流行病學調查結果已證實，人感染空腸彎曲桿菌與食用生的或未煮熟的家禽肉之間有著顯著地關系。人類每年都會因為這些病原菌感染而造成數(shù)百萬美元的損失。最近的流行病學調查數(shù)據(jù)顯示，在美國，沙門氏菌每年會導致約100萬例非傷寒沙門氏菌感染的病例，造成19 226人住院和378人死亡，而彎曲桿菌則會導致約80萬例病例，造成8 463人住院和76人死亡。

此外，據(jù)估計沙門氏菌和彎曲桿菌每年分別造成的經(jīng)濟損失約為44億和15億美元。家禽和家禽產品被認為是導致這些食源性疾病的重要來源。家禽產品是人類飲食中重要的一部分，在過去十年間家禽產品的人均消費量也在逐漸增加。因此，家禽及家禽產品的安全性是極為重要的，尤其對公眾健康和經(jīng)濟效益有著重要的影響。

腸炎沙門氏菌和空腸彎曲桿菌的自然宿主是雞，它們主要定殖于雞的腸道內，而盲腸是其定殖的主要部位。一旦定殖后，病原菌會通過糞便排泄到環(huán)境中，從而有可能污染環(huán)境，尤其是在成長舍會感染健康的禽群（橫向傳播）。此外，在屠宰或后續(xù)的處理過程中，受病原菌感染的或受污染的胴體可交叉感染其他胴體。在胴體的機械化加工處理期間，病原菌擁有大量的機會可從雞的表面轉移到其肉上。此外，當活禽送到加工廠后，要想使胴體的病原菌數(shù)量小于其活禽外表存在的病原菌數(shù)量，是非常不容易的。而且，機械化的去除內臟會導致這些病原菌從胃腸道中溢出，從而污染食用動物的胴體。美國農業(yè)部食品安全檢驗局收集了從2005年至2010年期間，肉雞胴體沖洗后腸炎沙門氏菌的檢出率情況。結果顯示，每年分離菌的總量增長4倍多，而且腸炎沙門氏菌陽性菌的確診量增加了3倍。此外，在美國，食用未煮熟的雞肉被認為是人零星感染腸炎沙門氏菌的一個危險因素。另一方面，空腸彎曲菌在肉雞內的定殖是非常普遍的，而且難以避免。在雞中，空腸彎曲菌主要定殖在盲腸和小腸的黏膜上皮細胞上。巖藻糖（L-Fucose），是雞盲腸粘液的粘蛋白中最主要的碳水化合物，可被空腸彎曲菌利用作為其生長的唯一底物。

因此，雞盲腸的環(huán)境是非常有利于空腸彎曲菌的生存和繁殖，并且是禽類空腸彎曲菌主要的定殖場所。除了家禽肉，受沙門氏菌污染的雞蛋也潛在的對公眾健康構成重大的威脅。這些病原菌可能是通過逆行傳播（從泄殖腔傳染到輸卵管）或經(jīng)卵傳播（從卵巢、卵泡或輸卵管傳染給雞蛋）而感染雞蛋。研究報告顯示，美國在1985年至1999年期間，已知病原的沙門氏菌疫情都是與雞蛋有關的。

同樣，已有研究結果顯示，在1985年至2003年期間，經(jīng)確認屬于食媒感染的腸炎沙門氏菌病例中，79%與雞蛋有關或含有雞蛋的成分。另一項研究報告發(fā)現(xiàn)，在美國，據(jù)估計發(fā)生了70萬例雞蛋源性沙門氏菌感染的病例，占總食源性沙門氏菌病例的47%，每年造成的經(jīng)濟損失超過10億美元。然而，美國食品安全檢驗局公布的一項調查研究表明，2000年在美國由于食用受腸炎沙門氏菌污染的雞蛋共造成182 060例病例。此外，一些流行病學調研結果已證實，沙門氏菌與食用雞蛋之間確實存在一定的關聯(lián)。2010年，美國共暴發(fā)3 578例與食用雞蛋有關的腸炎沙門氏菌病例。鑒于人類沙門氏菌與食用雞蛋之間存在關聯(lián)，2009年美國食品藥品管理局（FDA）宣布，雞蛋構成了腸炎沙門氏菌感染的一個重要來源，同時頒布了一項法案，要求雞蛋生產商積極采取措施，以防止腸炎沙門氏菌污染養(yǎng)殖場內的雞蛋，并預防在儲存和運輸過程中進一步的污染。

沙門氏菌和彎曲桿菌的控制策略

由于人食用受污染的雞肉或雞蛋會感染腸炎沙門氏菌或空腸彎曲菌，因此減少這些病原菌在雞腸道內的定殖，降低家禽產品受污染的水平是至關重要的。相關研究已鑒定出，防止或減少腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌在養(yǎng)殖場內雞群中定殖的幾個關鍵控制點。其中，最重要的關鍵控制點是，確保轉移入生長舍的小雞是無病原菌感染的。此外，受污染的飼料、墊料、水、嚙齒動物和昆蟲在腸炎沙門氏菌的傳播過程中也發(fā)揮著重要的作用。同樣的，轉移受感染的家禽，以及受污染的設備、飼料車和服務人員的走動也能夠促進病原菌在不同群體之間的傳播。英國一項對肉雞空腸彎曲菌來源的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場內的飼料、水和空氣中均存在病原菌。此外，彎曲桿菌可在肉雞舍下游多達30m處的空氣中檢測到，這尤為凸顯出了空氣傳播在病原菌的傳播過程中的潛在作用。除了飲水、飼料、空氣和帶菌雞群，蒼蠅、野鳥和嚙齒動物也是空腸彎曲菌重要的來源。由于腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌的傳染源多種多樣，因此在養(yǎng)殖場或生產基地內必須實施嚴格的生物安全措施，以減少這些病原菌的傳播。

防控家禽腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌的一種主要策略是屠宰前處理。這種干預的目的旨在減少病原菌在雞體內的定殖。降低腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌在雞腸道內的數(shù)量，以減少禽肉和雞蛋的污染。科研人員已探索出一系列減少上述兩種致病菌在雞體內定殖的措施，但成功程度各有不同。這些措施包括給小雞喂食具有競爭性作用的排斥菌、益生菌、噬菌體、甘露寡糖、低聚果糖、菊苣果聚糖、有機酸如乙酸、丙酸和甲酸、單寧酸和抗生素及其他抗菌藥物。此外，科研人員已經(jīng)開始進行一些疫苗接種措施的研究，以控制雞腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌。盡管采取了嚴格的預防控制方案，但是美國疾病預防控制中心的報告顯示，美國經(jīng)實驗室確診的沙門氏菌病例增加了3%（美國疾病預防控制中心，2012），這強調有必要采取一些替代的策略以控制這種食源性致病菌。

在解決這個問題的過程中，我們一直在調查研究一些植物分子對控制腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌的潛能。以下是評估幾種植物分子的抗菌功效所進行的研究，旨在提高家禽產品的安全性。

辛酸對腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌的作用

辛酸是一種天然的，存在于椰子油、棕櫚仁油、山羊奶和牛奶中的（含8個碳原子）中鏈脂肪酸，并被美國食品藥品管理局（FDA）批準為“通常視為安全的”（GRAS）食品級化學物質。我們首份報告的研究內容之一是，在迅速降低雞盲腸內容物的腸炎沙門氏菌（＞5.0 log cfu）方面，辛酸的體外抗菌潛能。有趣的是，辛酸可最低程度地抑制盲腸內源性厭氧菌的數(shù)量（P＜0.05）。此外，Van Immerseel和coworkers的研究結果已證實，中鏈脂肪酸（MCFA），特別是在小雞飼料中補充辛酸（3 g/kg飼料），可顯著地減少腸炎沙門氏菌在禽類的盲腸和內臟中定殖。他們發(fā)現(xiàn)，MCFA可抑制hilA的表達水平，而其是參與沙門氏菌入侵過程的一個關鍵的基因調控子，這可導致沙門氏菌在體內的定殖數(shù)量減少。而且，一些對豬群的研究結果表明，膳食中的辛酸在胃和小腸內達到殺菌濃度，可明顯地減少腸道的細菌負荷，且對生長性能無任何不良影響。

基于先前的研究數(shù)據(jù)證實，辛酸對腸炎沙門氏菌的體外抗菌效果，我們又進行了一項研究，以確定辛酸控制上市肉雞病原菌的預防性潛能。在雞群的飼料中補充0.7%或1%的辛酸，連續(xù)飼喂18日。結果顯示，在攻毒后第7天至第10天，飼料中補充0.7%和1%辛酸可持續(xù)減少雞群的盲腸、泄殖腔、肝、脾和小腸中腸炎沙門氏菌的數(shù)量（P＜0.05）。而試驗組和對照組試驗雞群之間，采食量和體重均沒有顯著的差異。組織學檢查結果顯示，補充辛酸后，雞群的盲腸和肝臟并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。此外，補充辛酸并沒有顯著的影響盲腸的PH或盲腸的內源性細菌?？偟膩碚f，飼料中預防性補充辛酸可能會減少雞腸炎沙門氏菌的定殖，且無不良的影響。

在預防性補充辛酸的研究基礎上，我們確定了辛酸對減少雞腸炎沙門氏菌的治療效果。在屠宰前5天，于3周齡或6周齡雞群的飼料中補充0.7%或1%的辛酸。與預防性補充試驗所得出的結果相似，補充0.7%或1%的辛酸均可顯著地減少兩組試驗雞群的盲腸、小腸、泄殖腔、肝和脾中腸炎沙門氏菌的數(shù)量（P＜0.05）。此外，試驗組和對照組試驗雞群之間，采食量和體重均沒有明顯的差異（P＞0.05）。總而言之，研究結果證實，辛酸有可能作為一種潛在的抗菌飼料添加劑，用于減少肉雞腸炎沙門氏菌的定殖。

此外，為了闡明辛酸對腸炎沙門氏菌的潛在抗菌機制，我們調查研究，辛酸的亞抑菌濃度（SIC；不能抑制細菌生長的低于最小抑菌濃度的最高濃度）是否可減少腸炎沙門氏菌侵襲虎皮鸚鵡腹部腫瘤細胞（BATC），禽小腸上皮細胞株，以及降低沙門氏菌侵襲基因，hilA和hilD的表達。結果顯示，辛酸可降低腸炎沙門氏菌菌株80%的侵襲能力（P＜0.05）。而且基因表達的研究結果證實，辛酸可下調沙門氏菌侵襲基因hilA和hilD的表達（P＜0.05）。

這些研究結果表明，補充辛酸可能是通過下調關鍵侵襲基因，hilA和hilD的表達而降低病原菌侵襲小腸上皮細胞的能力。這些結果與Van Immerseel等人在2004年的研究結果相一致。他們發(fā)現(xiàn)，中鏈脂肪酸（MCFA）可抑制hilA的表達，從而降低雞體內沙門氏菌的定殖。這些研究人員認為，中鏈脂肪酸（MCFA）有可能會減少沙門氏菌侵襲T-84上皮細胞株的能力。此外，相關研究表明，2 mmol的辛酸可降低鼠傷寒沙門氏菌侵襲豬上皮細胞的能力，以及下調細菌hilA和 hilD基因的表達。

除了這些研究以外，美國費耶特維爾的阿肯色州大學也開展了一系列調查研究，以確定辛酸對影響肉雞空腸彎曲菌定殖的潛能。在一項研究中，于1日齡雛雞的飼料中補充辛酸。研究結果顯示，補充0.7%的辛酸可減少空腸彎曲菌的定殖。而且，相關研究還探討了在15日齡的雛雞剖檢前72小時補充辛酸，以確定其對空腸彎曲菌的治療潛能。結果發(fā)現(xiàn)，補充0.7%和1.4%的辛酸可使盲腸的空腸彎曲菌數(shù)減少3 至5 log10 cfu/g。此外，研究證實，辛酸也可降低大齡雞盲腸的彎曲桿菌數(shù)量。Solis de los Santos等人研究發(fā)現(xiàn)，在試驗的最后3天或7天補充0.7%的辛酸，可持續(xù)地降低上市（42日齡）肉雞空腸彎曲菌的定殖，且無任何不良影響。有意思的是，當在試驗的最后3天補充0.7%的辛酸，即使是在12小時的停藥期之后，空腸彎曲菌的定殖量也會減少3 log10 cfu/g。

這些研究結果共同表明，當飼料中補充濃度為0.7%的辛酸時，可預防性和治療性地降低商品肉雞空腸彎曲桿菌的定殖，而且還可在休藥期間用于減少機體病原菌的攜帶量。

植物酚類物質對腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌的作用

植物精油是一類常被作為膳食成分的天然分子，尤其是用于保存食物和增強食品的風味。過往的研究已證實了一些植物精油的抗菌性能，而且也驗證了這些精油的各種活性成分。這些化合物有助于植物作為一種防御機制，以抵抗入侵的微生物和捕食者。雖然目前對香精油的抗菌性能有大量的數(shù)據(jù)，但大多數(shù)的研究都是采用標準肉湯系統(tǒng)進行的體外抗菌活性的研究，尤為強調提高食品安全所采取的的具體應用措施需經(jīng)過確認和驗證。

基于體外篩選一些對沙門氏菌和彎曲桿菌具有抗菌活性的植物抗菌素（PDA），我們發(fā)現(xiàn)4種分子，分別是反式肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚，在控制家禽的這些病原菌方面具有潛在用途。下文則主要對此進行探討。

反式肉桂醛，肉桂樹皮中提取的一種主要成分，是獲得美國食品藥品管理局（FDA）批準的，可用于食品中的一種GRAS化合物。美國香料萃取物生產者協(xié)會（FEMA）的報告稱，從亞慢性和慢性研究腸道的結果來看，反式肉桂醛在保守預估的攝入量和沒有觀察到毒副作用的水平之間，具有廣泛的安全性。該報告還指出，該化合物不具有遺傳毒性和致突變作用。此外，Michiels等人的研究顯示，給仔豬口服補充13.0 mg/kg體重的反式肉桂醛，并不會導致其產生任何的毒性作用。

而且，來自我們實驗室公布的數(shù)據(jù)表明，在體外試驗中，分別補充0.5%和1.5%的反式肉桂醛不會對人上皮細胞株和尿路細胞產生任何細胞毒性作用。反式肉桂醛對許多種不同的食源性病原性致病菌，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抗菌活性。已有的研究結果證實，反式肉桂醛對肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7具有抗菌活性。在另一項研究中，結果發(fā)現(xiàn)，反式肉桂醛在體外試驗中可抑制豬體內的多種病原菌，且不會對自然菌群產生任何有害影響。研究還發(fā)現(xiàn)，該化合物可在體外抑制鼠傷寒沙門氏菌DT104、大腸桿菌O157：H7、和其大腸菌群的活性，而有益菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的活性幾乎沒有受到抑制。

丁香酚是一種天然的分子，屬于丁香油中的一種有效成分。許多學者已證實了丁香油及丁香酚的抗菌活性。Si等人的研究結果顯示，在豬的體外模型中，丁香酚可抑制多種致病菌的活性，且不會產生任何有害影響。與反式肉桂醛相似，丁香酚也可降低鼠傷寒沙門氏菌DT104、大腸桿菌O157：H7和其他大腸菌群的活性，而對乳酸桿菌和雙歧桿菌無明顯地抑制作用（Si 等，2006）。在另一項研究中，Michiels等人研究發(fā)現(xiàn)，給仔豬補充劑量為12.5 mg/kg體重的丁香酚不會對機體造成任何毒副作用。

香芹酚和百里香酚是從腺毛牛至中提取的牛至精油的主要成分。這種精油已被證實可有效地對抗胃腸道和泌尿生殖道的細菌和真菌感染。

在這些研究報告的基礎上，我們進行了一系列的試驗，包括采用體外模型研究這些植物分子的抗沙門氏菌和抗彎曲桿菌的潛能。我們主要采用的是盲腸內容物，因為與人工合成的實驗媒介相比，這種溶媒更接近雞盲腸的內環(huán)境。我們觀察到在所有植物抗菌素（PDA）的測試中，反式肉桂醛在減少盲腸內容物的腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌方面具有最顯著的效果，而且不會影響整體盲腸內源性菌群的數(shù)量。與空白對照組相比，補充0.2%和0.35%的反式肉桂醛可在培養(yǎng)24小時后使腸炎沙門氏菌滅活9 log 10 cfu/mL。雖然與反式肉桂醛相比表現(xiàn)出稍微較低的抗菌潛力，但補充0.75%和1%的其他分子，如丁香酚、香芹酚和百里香酚也可在24小時的培養(yǎng)期后使病原菌的數(shù)量顯著地減少。研究還發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲菌對所有的植物抗菌素都更加敏感。例如，補充0.1%的植物抗菌素可在培養(yǎng)24小時后可顯著地減少病原菌的數(shù)量。

空腸彎曲菌常被認為是一種難以培養(yǎng)的脆弱的細菌，尤其是當其離開宿主的時候，這從而解釋了植物分子為什么對其敏感性會增加。飲水是雞腸炎沙門氏菌的主要來源。被感染雞的飼料和糞便所污染的水有可能會導致病原菌在雞體內定殖。為了確定反式肉桂醛對減少及飲水中腸炎沙門氏菌的效果，我們進行了一項研究，采用從康涅狄格大學家禽養(yǎng)殖場收集到的自來水分別加入或不加入受污染的糞便（濃度為1%）或飼料（濃度為1%）。結果發(fā)現(xiàn)，補充0.06%的反式肉桂醛可在12.5℃和25℃含有1%糞便的水中24小時后完全滅活腸炎沙門氏菌。結果表明，反式肉桂醛對殺死飲水中雞腸炎沙門氏菌是有效的，并有可能作為一種添加劑，以控制水源性腸炎沙門氏菌在雞群內的定殖。

在對植物分子的體外抗菌潛能進行了探究之后，相關研究開始評估植物分子對減少腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌在雞腸道內定殖的功效。一項研究檢測了反式肉桂醛和丁香酚對上市日齡肉雞腸炎沙門氏菌的預防效果。于家禽飼料中分別補充0.5%或0.75%的反式肉桂醛和0.75%或1%的丁香酚，連續(xù)飼喂20天。結果顯示，補充0.5%和0.75%的反式肉桂醛，以及補充1%的丁香酚可在感染10天后，雞群盲腸內沙門氏菌的減少量大于3 log 10 cfu/g（P＞0.05）。而且該化合物既不會改變PH值，也不會影響內源性盲腸菌群的數(shù)量（P＞0.05）。反式肉桂醛補充組與對照組試驗雞群相比，采食量和體重均沒有明顯的差異（P＞0.05）。然而，丁香酚補充組與對照組試驗雞群相比，體重卻出現(xiàn)顯著地降低（P＜0.05）。

在后續(xù)的研究中，對上市日齡肉雞進行了兩項試驗研究，以確定反式肉桂醛和丁香酚對雞腸炎沙門氏菌的治療效果。在肉雞上市屠宰前5天，于其飼料中補充0.75%的反式肉桂醛和1%的丁香酚作為一種抗菌添加劑。結果發(fā)現(xiàn)，兩項試驗的2種分子均能持續(xù)顯著地降低腸炎沙門氏菌的數(shù)量（P＜0.05）。植物分子可使盲腸內腸炎沙門氏菌的定殖減少1.5 log 10 cfu/g（P＜0.05）。 而 反式肉桂醛和丁香酚可分別使泄殖腔內腸炎沙門氏菌的數(shù)量減少1.5 log 10 和2 log10 cfu/g（P ＜ 0.05）。

此外，為了確定植物抗菌素（PDA）對減少肉雞腸炎沙門氏菌定殖的功效，目前我們實驗室正在研究這些分子降低蛋雞內的病原菌垂直傳播給雞蛋的潛能。初步結果表明，這些分子可有效地減少病原菌的垂直傳播。此外，植物抗菌素可減少腸炎沙門氏菌粘附和侵襲雞輸卵管上皮細胞，以及下調決定輸卵管定殖水平的關鍵基因的表達。

相關研究還檢測了植物化合物香芹酚和百里香酚對減少肉雞空腸彎曲菌數(shù)的功效。在最近的一份報告中得出的結論是，這些分子可減少空腸彎曲菌的定殖，但仍需進行更多的研究，以確保制定出一致的治療方案。補充0.25%和1%的百里香酚、1%的香芹酚或0.5%的分子混合物均可有效地抑制肉雞空腸彎曲菌的定殖，但其效果并不一致。在另一項研究中，Hermans等人采用排毒雛雞模型，研究了肉桂醛對減少空腸彎曲菌KC40的功效。結果顯示，飼料中含有0.3%（包囊型）的肉桂醛，不能顯著地減少病原菌的數(shù)量。

香精油或其成分的一個關鍵特性是它們的疏水性，有助于其針對含脂的細菌細胞膜。這使得這些膜更具有滲透性，從而導致離子和其他細胞內容物的流失、。除了對細胞膜的功效，反式肉桂醛也被認為可通過抑制能量生成和葡萄糖攝取而殺滅細菌。此外，反式肉桂醛和丁香酚殺滅微生物的另一種機制是通過抑制一些關鍵酶的活性，如氨基酸脫羧酶來實現(xiàn)的。由于植物分子中含有一些化學基團的結構，因此其抗菌活性歸因于多種特異的作用機制。所以，我們假設細菌對植物抗菌劑產生耐藥性的潛能是可以忽略的。

為了確定殖物分子對細菌致病機制的潛在影響，我們調查研究，反式肉桂醛和丁香酚能否減少腸炎沙門氏菌侵襲虎皮鸚鵡腹部腫瘤細胞的能力（BATC）。結果顯示，反式肉桂醛和丁香酚可降低腸炎沙門氏菌的侵襲能力，并可下調侵襲基因hilA、hilD和invF，以及運動性基因、flhC和motA的表達（P＜0.05）。而且，這些分子可顯著地降低病原菌的運動性（P＜0.05）。

鑒于反式肉桂醛和丁香酚能夠降低病原菌的侵襲力和運動性，我們從暴露于亞抑菌濃度植物分子內的腸炎沙門氏菌中提取RNA進行微列陣研究，以闡明反式肉桂醛或丁香酚下調基因的可能途徑。細菌接觸一種抑制劑的表達譜分析可對基因通路的特性給予新的信息，并可研究抑制劑的作用機制。我們微列陣的數(shù)據(jù)顯示，這些分子可下調腸炎沙門氏菌在厭氧條件下，調控沙門氏菌毒力島、3型分泌系統(tǒng)、外膜蛋白、代謝途徑和電子受體等基因的表達。目前，我們正在調查研究亞抑菌濃度的植物抗菌素對空腸彎曲菌全基因組的反應。

結論

雖然在食品安全中通過實施病原菌控制計劃已取得了實質性的進展，但是腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌仍然是家禽產品最常見的可傳染給人類的食源性病原菌。因此，創(chuàng)新型的農場策略以防止這些病原菌在家禽中定殖，對減少或預防家禽產品的污染來說是至關重要的。在飼料或飲水添加抗菌藥物的治療措施是養(yǎng)殖戶所能接受的最實用且最經(jīng)濟可行的方法。而且，天然安全的抗菌藥因具有無毒性的特點，將會更受養(yǎng)殖生產者，包括有機農產品生產者的青睞?？偠灾?，我們的研究表明，辛酸、反式肉桂醛、丁香酚、香芹酚作為膳食補充劑，以減少雞腸炎沙門氏菌和空腸彎曲菌的數(shù)量。此外，微列陣數(shù)據(jù)顯示，這些分子可能會通過抑制細菌的毒力和定殖的機制來減少病原菌的數(shù)量。