湯南,萬(wàn)潔,陳博,張媛,陳鴻鵬

(1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞 523808； 2廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院；3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院；4廣東醫(yī)科大學(xué)信息工程學(xué)院)

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·基礎(chǔ)研究·

紫杉醇、多西紫杉醇對(duì)大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞縫隙連接功能的影響

湯南1,萬(wàn)潔2,陳博2,張媛3,陳鴻鵬4

(1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞 523808； 2廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院；3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院；4廣東醫(yī)科大學(xué)信息工程學(xué)院)

目的觀察紫杉醇、多西紫杉醇對(duì)大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞縫隙連接(GJ)功能的影響。方法采用磺酰羅丹明B比色法篩選紫杉醇和多西紫杉醇不影響B(tài)RL-3A細(xì)胞生長(zhǎng)的作用濃度。采用細(xì)胞接種熒光示蹤法與劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)檢測(cè)紫杉醇與多西紫杉醇作用BRL-3A后細(xì)胞GJ功能。結(jié)果篩選出的紫杉醇、多西紫杉醇藥物濃度均為0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。與溶劑對(duì)照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率降低(P均<0.05)，多西紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率無(wú)明顯變化。與溶劑對(duì)照組相比，紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離縮短，多西紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離無(wú)明顯變化。結(jié)論紫杉醇可顯著抑制大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞GJ功能，而多西紫杉醇則不影響GJ功能。

紫杉醇；多西紫杉醇；細(xì)胞縫隙鏈接；肝細(xì)胞株；BRL-3A細(xì)胞

細(xì)胞縫隙連接(GJ)是相鄰細(xì)胞間進(jìn)行直接信號(hào)與物質(zhì)交流的膜通道，由連接蛋白(Cx)組成。6個(gè)Cx亞單位環(huán)行排列組成一個(gè)“連接子”，其中心形成一個(gè)孔道[1]。相鄰細(xì)胞膜上的兩個(gè)“連接子”對(duì)接后組裝為一個(gè)GJ通道，分子量﹤1～2 kDa的小分子或第二信使等物質(zhì)可通過(guò)GJ在毗鄰細(xì)胞間擴(kuò)散、傳遞和轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。GJ所介導(dǎo)的細(xì)胞間直接接觸的通信方式是細(xì)胞生物學(xué)行為的重要調(diào)控形式，在細(xì)胞的新陳代謝、增殖分化、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。紫杉烷類(lèi)抗腫瘤藥物——紫杉醇與多西紫杉醇是目前臨床上廣泛使用的一類(lèi)廣譜化療藥，對(duì)乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌及非小細(xì)胞肺癌等有較好的療效。但作為細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥，它們?cè)跉┘?xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞及組織器官也有一定的損害，其中對(duì)肝臟的損傷引起研究人員越來(lái)越多的關(guān)注[3～6]。肝細(xì)胞中分布較多的GJ，觀察紫杉醇與多西紫杉醇對(duì)肝細(xì)胞GJ連接功能的影響，可為紫杉烷類(lèi)抗腫瘤藥物肝損傷的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試劑、儀器及細(xì)胞株紫杉醇與多西紫杉醇(Sigma-Aldrich公司)；Calcein-AM及CM DiI(Invitrogen公司)；熒光黃(LY，Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基，新生牛血清，0.25%胰酶和青-鏈霉素(Gibco公司)；其他試劑均為常用分析純。酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，IX51熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。實(shí)驗(yàn)所用大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A購(gòu)自ATCC。

1.2紫杉醇、多西紫杉醇給予方法及其對(duì)BRL-3A細(xì)胞GJ功能的影響采用磺酰羅丹明B比色法(SRB法)對(duì)紫杉醇、多西紫杉醇的劑量(不引起細(xì)胞毒性)進(jìn)行篩選，確定合適藥物濃度均為0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。采用以下兩種方法觀察紫杉醇、多西紫杉醇對(duì)BRL-3A細(xì)胞GJ功能的影響。①細(xì)胞接種熒光示蹤法：將BRL-3A細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，分別加入0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L的紫杉醇和0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇作用1 h，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組(采用溶劑處理BRL-3A細(xì)胞)。取其中一孔空白細(xì)胞加入熒光指示劑Calcein-AM孵育30 min，作為“供體細(xì)胞”。胰酶消化收集熒光標(biāo)記好的“供體細(xì)胞”，接種到已生長(zhǎng)融合的其他孔BRL-3A細(xì)胞(“接受細(xì)胞”)上,培養(yǎng)4 h。用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)1個(gè)“供體細(xì)胞”周?chē)蠧alcein的“接受細(xì)胞”數(shù)，與溶劑對(duì)照組比較，計(jì)算Calcein熒光傳遞率。②劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)：將BRL-3A細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，加入1.0 μmol/L的紫杉醇和1.0 μmol/L的多西紫杉醇作用1 h，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組(采用溶劑處理BRL-3A細(xì)胞)，吸去6孔板中的培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入300 μL 0.5% LY，用手術(shù)刀片迅速做一劃痕，將6孔板避光孵育3 min，PBS洗3次后熒光顯微鏡下觀察LY的傳輸距離。

2　結(jié)果

與溶劑對(duì)照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率降低(P均<0.05)，分別為82.48%±4.75%、80.20%±5.09%、78.90%±7.74%和73.75%±9.85%。與溶劑對(duì)照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率分別為100.67%±1.00%、102.35%±3.93%、96.40%±6.60%、94.12%±10.51%。與溶劑對(duì)照組相比，紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離縮短(約4層)，多西紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離無(wú)明顯變化(約7層)。

3　討論

抗腫瘤藥物所致肝損傷在所有藥物性肝損傷中占很大比重。紫杉醇和多西紫杉醇是目前公認(rèn)的對(duì)多種腫瘤具有確切療效的廣譜化療藥物，肝臟是二者代謝的主要臟器，該類(lèi)藥物導(dǎo)致的肝損傷將不可避免地直接干擾其體內(nèi)代謝過(guò)程，從而影響療效發(fā)揮。目前，關(guān)于紫杉醇和多西紫杉醇引起肝損傷的機(jī)制研究?jī)H有較少的報(bào)道，主要認(rèn)為是與ROS自由基等有害物質(zhì)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[7,8]。

GJ是相鄰細(xì)胞間形成的一種可以開(kāi)放和關(guān)閉的膜通道結(jié)構(gòu)，GJ通信是生物體內(nèi)細(xì)胞之間直接的信息交流，小分子物質(zhì)及某些信號(hào)分子可以通過(guò)GJ在細(xì)胞間傳遞。GJ廣泛存在于實(shí)質(zhì)性臟器組織(如肝臟、心臟、腎臟、肺等)中。組成GJ的Cx目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有21種[1]，Cx依據(jù)其分子量進(jìn)行命名。不同Cx組成的GJ通道對(duì)物質(zhì)和信號(hào)的傳遞具有選擇通透性。ATP和谷氨酸易于通過(guò)Cx43通道，而三磷酸肌醇和腺苷則易通過(guò)Cx32通道[9～11]。這種選擇通透性與GJ調(diào)節(jié)的生理功能有關(guān)，GJ通道功能改變將影響細(xì)胞之間的正常通信，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。研究[12～14]證實(shí)GJ異常與腫瘤、血栓、癲癇等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。在大多數(shù)腫瘤的形成階段常伴隨著GJ功能的降低或消失，改善或恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的GJ功能可增強(qiáng)順鉑、奧沙利鉑等抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性[15]。這可能與GJ介導(dǎo)的“損傷信號(hào)”傳遞有關(guān)。

肝細(xì)胞中富含Cx32組成的GJ[16～18]，由于GJ在物質(zhì)和信號(hào)傳遞中的重要調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)GJ與藥物性肝損傷的關(guān)系引起研究人員的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，在不引起細(xì)胞毒性的條件下，紫杉醇抑制肝細(xì)胞的GJ功能，而多西紫杉醇對(duì)此GJ功能則無(wú)明顯影響。兩藥顯示出的不同作用，將可能體現(xiàn)出信號(hào)分子在肝細(xì)胞間傳遞的差異性，這為二者肝損傷的研究提供了新的方向。

[1] Maeda S, Tsukihara T. Structure of the gap junction channel and its implications for its biological functions[J]. Cell Mol Life Sci, 2011,68:1115-1129.

[2] Nihei OK, Fonseca PC, Rubim NM, et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells[J]. BMC Cell Biol, 2010,11:3.

[3] Karaduman D, Eren B, Keles ON. The protective effect of beta-1,3-D-glucan on taxol-induced hepatotoxicity: a histopathological and stereological study[J]. Drug Chem Toxicol, 2010,33(1):8-16.

[4] Wang Z, Liang X, Yu J. et al. Non-genetic risk factors and predicting efficacy for docetaxel--drug-induced liver injury among metastatic breast cancer patients[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012,27(8):1348-1352.

[5] Liang X, Zhang J, Zhu Y, et al. Specific genetic polymorphisms of IL10-592 AA and IL10-819 TT genotypes lead to the key role for inducing docetaxel-induced liver injury in breast cancer patients[J]. Clin Transl Oncol, 2013,15(4):331-334.

[6] 羅安福,葉冬梅.常用抗腫瘤藥物致肝損害的研究概況[J].醫(yī)學(xué)綜述,2010,16(24):3725-3727.

[7] 葉冬梅,韋海明,蘭順,等.紫杉醇和多烯紫杉醇致肝損害的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011,22(1):182-184.

[8] 潘模英,倪秀雄,姚琦,等.紫杉醇和環(huán)磷酰胺致肝損傷程度的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2004,27(3):17-18.

[9] 李立，唐羅生.細(xì)胞間隙連接蛋白與腫瘤[J].國(guó)際眼科雜志,2007,7(1):175-178.

[10] Niessen H, Harz H, Bedner P, et al. Selective permeability of different connexin channels to the second messenger inositol 1,4,5-trisphosphate[J]. J Cell Sci, 2000,113:1365-1372.

[11] Jorgensen NR, Geist ST, Civitelli R, et al. ATP- and gap junction-dependent intercellular calcium signaling in osteoblastic cells[J]. J Cell Biol, 1997,139(2):497-506.

[12] Kandouz M, Batist G. Gap junctions and connexins as therapeutic targets in cancer[J]. Expert Opin Ther Targets, 2010,14(7):681-692.

[13] Vaiyapuri S, Jones CI, Sasikumar P,et al. Gap junctions and connexin hemichannels underpin hemostasis and thrombosis[J]. Circulation, 2012, 25(20):2479-2491.

[14] Bedner P, Steinhauser C. Altered Kir and gap junction channels in temporal lobe epilepsy[J]. Neurochem Int, 2013,63(7):682-687.

[15] Wang Q, You T, Yuan D, et al. Cisplatin and oxaliplatin inhibit gap junctional communication by direct action and by reduction of connexin expression, thereby counteracting cytotoxic efficacy[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2010,333(3):903-911.

[16] Kumar NM, Gilula NB. Cloning and characterization of human and rat liver cDNAs coding for a gap junction protein[J]. J Cell Biol, 1986,103(3):767-776.

[17] Koffler LD, Fernstrom MJ, Akiyama TE, et al. Positive regulation of connexin32 transcription by hepatocyte nuclear factor-1α[J]. Arch Biochem Biophys, 2002,407(2):160-167.

[18] Segretain D, Falk MM. Regulation of connexin biosynthesis, assembly, gap junction formation, and removal[J]. Biochim Biophys Acta, 2004,1662(1-2):3-21.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81400619)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2014472，A2013428)。

陳鴻鵬(E-mail： chenhpgdmc@foxmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.009

R73

A

1002-266X(2016)23-0031-03

2015-11-26)