陳綺丹,萬瑜

(廣州番禺區(qū)中心醫(yī)院,廣州511400)

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Hp感染胃癌患者胃黏膜組織中PTEN表達(dá)變化及其機(jī)制

陳綺丹,萬瑜

(廣州番禺區(qū)中心醫(yī)院,廣州511400)

目的 探討幽門螺桿菌(Hp)感染與非感染胃癌患者胃黏膜組織中人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)的表達(dá)變化及其機(jī)制。方法 Hp感染及非感染胃癌患者的胃黏膜組織各50例，分別命名為Hp陽性組和Hp陰性組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting法檢測兩組胃黏膜組織中PTEN、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1) mRNA及蛋白表達(dá)；采用巢式降落式甲基化特異性PCR法檢測兩組胃黏膜組織中PTEN DNA甲基化水平。結(jié)果 Hp陽性組胃黏膜組織中PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平與Hp陰性組比較降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；Hp陽性組胃黏膜組織中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平與Hp陰性組比較升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Hp陽性組胃黏膜組織中DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平與Hp陰性組比較升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 Hp感染胃癌患者胃黏膜組織中PTEN表達(dá)降低，而PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化可能是其表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制。

胃腫瘤；幽門螺桿菌；人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；DNA甲基化；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1

幽門螺桿菌(Hp)不僅是引起消化性潰瘍等胃腸道疾病的主要病原菌，其感染導(dǎo)致的慢性胃炎還是致胃癌的危險(xiǎn)因素[1，2]，且國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(WTO-IARC)已將Hp列入第一類致癌因子。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，Hp陽性胃癌胃黏膜組織中PTEN表達(dá)水平顯著低于Hp陰性的胃癌患者，但其機(jī)制仍不清楚[4]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要機(jī)制，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)主要負(fù)責(zé)維持性甲基化，且其過表達(dá)與胃癌的發(fā)生亦密切相關(guān)[5]。但在Hp相關(guān)胃癌中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平是否發(fā)生改變及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究旨在探討Hp感染和非感染胃癌患者胃黏膜組織中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平是否發(fā)生改變及其機(jī)制，為Hp相關(guān)胃癌的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年8月～2016年8月于本院消化內(nèi)科內(nèi)鏡中心內(nèi)鏡下活檢的胃癌組織標(biāo)本。胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)：纖維胃鏡檢查結(jié)合刷取脫落細(xì)胞和鉗取活組織檢查，鏡檢可見胃癌病變征象，脫落細(xì)胞和活體組織檢查找到癌細(xì)胞。Hp感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：胃黏膜直接染色涂片鏡檢，見螺旋形革蘭陰性螺旋桿菌，快速脲酶試驗(yàn)陽性。Hp感染和非感染胃癌患者各50例。Hp陽性組：男34例、女16例，年齡25～80(54±6.2)歲。Hp陰性組：男28例、女22例，年齡28～77(56±5.8)歲。所有病例術(shù)前未經(jīng)放化療治療。

1.2 胃黏膜組織中PTEN及DNMT1 mRNA表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR法。在Pubmed數(shù)據(jù)庫中查詢PTEN及DNMT1并獲取其編碼序列，采用Premier5.0設(shè)計(jì)相關(guān)引物，PTEN、DNMT1、GAPDH產(chǎn)物長度分別為101、118、115 bp。提取各組胃黏膜組織的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 8.9 μL，2×SYBR Green Mix 12.5 μL，共25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH表達(dá)量為參照，進(jìn)行相對定量分析。

1.3 胃黏膜組織中PTEN及DNMT1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。用全蛋白提取試劑盒提取兩組胃黏膜組織全蛋白，取20 μL進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)恒壓15 V 15 min，5%的脫脂奶粉封閉2 h，與anti-PETN或anti-DNMT1 4 ℃搖床上孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗常溫?fù)u床孵育2 h，于凝膠成像分析儀上成像分析，以β-actin表達(dá)量為參照，計(jì)算PTEN、DNMT1與β-actin條帶灰度值的比值。

1.4 胃黏膜組織中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平檢測 采用巢式降落式甲基化特異性PCR(nt-MSP)法。按照DNA提取試劑盒說明書操作步驟提取兩組胃黏膜組織全基因組DNA，采用亞硫酸鹽修飾法對提取的全基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾。nt-MSP法檢測PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度的改變。針對PTEN啟動(dòng)子區(qū)，在線(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)設(shè)計(jì)一對外引物及兩對內(nèi)引物。外引物擴(kuò)增體系反應(yīng)條件：修飾DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，熒光mix 12.5 μL，共25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.5～50 ℃，72 ℃ 7 min。接著以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行內(nèi)外引物的擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同外引物。取內(nèi)引物的PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠上樣電泳，凝膠成像分析儀成像，并分析甲基化條帶與非甲基化條帶的光密度值，按如下公式計(jì)算：甲基化(%)=甲基化OD值/(甲基化OD值+非甲基化OD值)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胃黏膜組織中PTEN mRNA及蛋白表達(dá)比較 Hp陽性組與Hp陰性組胃黏膜組織中PTEN mRNA相對表達(dá)量分別為0.598、0.960，蛋白相對表達(dá)量分別為0.538、0.940，兩組PTEN mRNA及蛋白表達(dá)比較，P均<0.05。

2.2 兩組胃黏膜組織中DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)比較 Hp陽性組與Hp陰性組胃黏膜組織中DNMT1 mRNA相對表達(dá)量分別為3.381、1.289，蛋白相對表達(dá)量分別為0.827、0.451，兩組DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)比較，P均<0.05。

2.3 兩組胃黏膜組織中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平比較 在線查看PTEN啟動(dòng)子區(qū)CpG島分布情況，結(jié)果顯示PTEN啟動(dòng)子區(qū)富含CpG島。MSP檢測兩組胃黏膜組織中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平，結(jié)果顯示，Hp陽性組與Hp陰性組胃黏膜組織中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平分別為0.561、0.330，兩組比較，P<0.05。

3 討論

Hp感染是一個(gè)世界性問題，且中國Hp的感染率較高。Hp引起的慢性胃炎和胃潰瘍亦是胃癌的危險(xiǎn)因素，Hp感染與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Hp致病機(jī)制復(fù)雜，對胃黏膜的損傷不僅與其黏附作用、毒力因子對黏膜細(xì)胞的直接損傷有關(guān)，而且與其促進(jìn)胃黏膜炎癥、免疫反應(yīng)等亦有密切聯(lián)系[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，Hp感染能擾亂部分致癌基因和抑癌基因的功能[7,8]，其中PTEN在胃癌中發(fā)揮重要作用[9，10]。

PTEN是近年來在磷酸酶家族中發(fā)現(xiàn)的首個(gè)腫瘤抑制基因，具有編碼蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性蛋白的雙特異性，廣泛作用于多種細(xì)胞信號(hào)通路，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。Zeng等[11]研究表明，在人類胃癌中，miR-370可通過靶向調(diào)控PTEN表達(dá)進(jìn)而抑制癌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；Guo等[12]研究表明，假基因PTENP1可通過調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)抑制胃癌進(jìn)展；Kim 等[13]研究表明，活化的PTEN可通過抑制Notch信號(hào)通路使胃癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯?？梢?，PTEN在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但以上研究并未區(qū)分是否有Hp感染，忽略了Hp在胃癌發(fā)生發(fā)展中對PTEN的影響。本研究結(jié)果顯示，Hp陽性組胃黏膜組織中PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示PTEN可能在Hp感染相關(guān)胃癌中發(fā)揮作用，與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容，其指CpG位點(diǎn)的胞嘧啶(C)被甲基(-CH3)修飾，從而在基因結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變的情況下調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化改變狀態(tài)包括低甲基化和高甲基化，一般來講，低甲基化促進(jìn)基因表達(dá)，高甲基化抑制基因表達(dá)。Compare等[14]研究表明基因組DNA低甲基化可能是Hp相關(guān)胃癌發(fā)生的早期事件；Niwa等[15]研究表明，由Hp感染觸發(fā)的炎癥可導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞的異常甲基化?？梢姡珼NA甲基化在Hp感染相關(guān)胃癌中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示Hp陽性組胃黏膜組織中PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平顯著升高，而DNA高甲基化是基因轉(zhuǎn)錄抑制的重要標(biāo)志，與PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平降低相一致；且Hp陽性組胃黏膜組織中DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，與上述結(jié)果一致。提示Hp可能通過DNA甲基化抑制PTEN表達(dá)從而促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Hp感染可能通過提高DNMT1表達(dá)進(jìn)而提高PTEN啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度，使其表達(dá)水平降低，從而促進(jìn)Hp相關(guān)胃癌的發(fā)生，本研究為Hp相關(guān)胃癌的防治提供了新思路。

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