陽祖慶,江志遠(yuǎn),鐘武,王時俊,曹云飛

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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結(jié)直腸癌患者外周血LAP+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分離純化及功能鑒定

陽祖慶,江志遠(yuǎn),鐘武,王時俊,曹云飛

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 應(yīng)用免疫磁珠分選法分離純化結(jié)直腸癌患者外周血中LAP+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(LAP+CD4+T)，并對分選獲得的目的細(xì)胞進(jìn)行體外功能的初步研究。方法 按照免疫磁珠兩步法(陰性分選和陽性分選)分離結(jié)直腸癌患者外周血單個核細(xì)胞中的LAP+CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測分選后細(xì)胞的純度；臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率；CCK-8摻入法檢測其對LAP-CD4+T細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)；ELISA法檢測體外細(xì)胞因子TGF-β和IL-10表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)免疫磁珠法分選獲得的LAP+CD4+T細(xì)胞純度為(95.16±2.11)%，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率為(93.64±1.33)%。CCK-8摻入法檢測結(jié)果顯示LAP+CD4+T細(xì)胞干預(yù)后LAP-CD4+T細(xì)胞生長明顯受到抑制(P=0.000)；ELISA結(jié)果顯示LAP+CD4+T細(xì)胞較LAP-CD4+T細(xì)胞分泌更高濃度的細(xì)胞抑制因子TGF-β和IL-10(P=0.000)。結(jié)論 免疫磁珠法分選結(jié)直腸患者外周血中LAP+CD4+T細(xì)胞具有高效、快捷、純度高等優(yōu)點，且不損傷細(xì)胞活性。

結(jié)直腸癌；免疫磁珠法；LAP+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

結(jié)直腸癌(CRC)是胃腸道疾病中常見的惡性腫瘤，美國國家癌癥協(xié)會2014年最新數(shù)據(jù)顯示，CRC的發(fā)病率和病死率排在常見致死性惡性腫瘤疾病的第三位[1]。目前我國CRC病死率排在惡性腫瘤死亡疾病的第五位[2]。CRC的惡性增殖與機體免疫功能下降及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸分不開[3,4]。已有研究結(jié)果顯示調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞可富集到胃癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤患者的外周血及其腫瘤組織中，提示其可能參與胃癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[3～5]，并且在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。LAP+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(LAP+CD4+T)是新近發(fā)現(xiàn)不同于傳統(tǒng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的新型CD4+T細(xì)胞亞群，體內(nèi)外實驗[6]證實其與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，且較傳統(tǒng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有更強的免疫抑制功能，但其在CRC中的發(fā)病機制尚不明確。因此如何從CRC患者外周血中簡便、快速分離出高純度LAP+CD4+T細(xì)胞，對今后研究LAP+CD4+T細(xì)胞將有重要意義。本研究旨在探索一種能用于體外分離和純化CRC患者外周血LAP+CD4+T細(xì)胞的方法，為LAP+CD4+T細(xì)胞在CRC臨床及基礎(chǔ)研究中提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年6月～2015年1月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科新入院經(jīng)病理診斷為CRC患者27例，男11例、女16例，年齡32～70歲，平均52歲?；颊咝g(shù)前均未接受任何化學(xué)或放射治療及免疫治療，且術(shù)前檢查均排除自身免疫性及感染性疾病。本研究均符合人體實驗倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，獲本院倫理委員會批準(zhǔn)及所有受試者本人同意。

1.2 單個核細(xì)胞懸液的制備 抽取患者新鮮外周血6 mL并緩慢加入裝有6 mL Ficoll-hypaque淋巴細(xì)胞分離液的15 mL無菌離心管中，2 500 r/min，離心30 min，吸取中間云霧狀細(xì)胞，即為外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，用經(jīng)高壓滅菌的PBS液洗滌2次，再以含1%胎牛血清(PBS)液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度至5×107/mL，至少取1 mL細(xì)胞懸液置于10 mL無菌離心管中用于磁珠分選實驗。

1.3 磁珠陰性CD4+T細(xì)胞分選 將單個核細(xì)胞懸液按1×105/mL 比例放于5 mL的聚乙烯試管中。按50 μL/mL 加入 Easysep Human CD4+T Cell enrichment cocktail混勻，室溫(15～25 ℃)孵育10 min。再加入含抗生物素標(biāo)記的磁珠混勻后避光室溫孵育10 min。Buffer洗滌后1 500 r/min，離心5 min棄上清液，沉淀用1 mL Buffer重懸。將MS柱置于MACS分選系統(tǒng)中MPC架上，用2 mL Buffer過柱，然后將細(xì)胞懸液加入柱內(nèi)，再用1 mL Buffer洗柱并收集從分選柱中流出的細(xì)胞。取少量細(xì)胞加入抗CD4-FITC標(biāo)記的抗體，用流式細(xì)胞儀分析CD4+T 細(xì)胞的純度。

1.4 磁珠陽性LAP+CD4+T細(xì)胞分選 將CD4+T細(xì)胞懸液調(diào)整至0.5×105/mL，900 μL Buffer重懸，加入100 μL Easysep Positive selection cocktail室溫孵育15 min，再加入50 μL Easysep SA 磁性微粒避光室溫孵育15 min。將MS柱置于MACS分選系統(tǒng)中MPC架上，1 mL Buffer過柱，然后將重懸的細(xì)胞液加入柱內(nèi)，用1 mL Buffer洗柱，收獲流下來的液體即為LAP-CD4+T細(xì)胞，然后將MS柱移開磁場放入一個無菌收集管中，快速向柱中加入1 mL Buffer并用活塞將磁珠標(biāo)記的LAP+CD4+T細(xì)胞沖出柱子。Buffer洗滌2次，沉淀用1 mL Buffer重懸，分別取少量細(xì)胞懸液加入抗LAP-PE標(biāo)記(LAP)潛肽相關(guān)多肽的抗體后用流式細(xì)胞儀分析 LAP+CD4+T細(xì)胞及LAP-CD4+T細(xì)胞的純度。另外分別留取LAP+CD4+T細(xì)胞和LAP-CD4+T細(xì)胞進(jìn)行增殖抑制試驗。

1.5 LAP+CD4+T細(xì)胞活性和抑制功能的鑒定 取15 μL細(xì)胞懸液用4 g/L的臺盼藍(lán)染料進(jìn)行染色，按照細(xì)胞存活率=染色陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，觀察并計算細(xì)胞存活率。分別選取陽性分選的LAP+CD4+T細(xì)胞和陽性分選時收集的LAP-CD4+T細(xì)胞各0.5×105，按1∶1比例共同培養(yǎng)于經(jīng)人CD3、CD28單抗包被的96孔板中，另外設(shè)置兩個對照組(即LAP+CD4+T細(xì)胞、LAP-CD4+T細(xì)胞單獨培養(yǎng))，并設(shè)置復(fù)孔，每孔添加IL-2 200 U。細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃恒溫箱中48 h，在培養(yǎng)結(jié)束前3 h每孔加入CCK-8 10 μL，在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測并記錄每孔細(xì)胞的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 細(xì)胞因子的初步檢測 分別取單獨培養(yǎng)48 h后的LAP+CD4+T細(xì)胞和LAP-CD4+T細(xì)胞上清液20 μL，應(yīng)用ELISA試劑盒按照操作說明檢測細(xì)胞因子TGF-β、IL-10含量，并根據(jù)Curve Exper軟件所制作出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的細(xì)胞因子濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不服從正態(tài)分布時采用秩和檢驗，方差不齊時采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫磁珠分選后的細(xì)胞純度 經(jīng)免疫磁珠陰性分選獲得的CD4+T細(xì)胞的純度為(93.57±1.87)%，陽性分選后LAP+CD4+T細(xì)胞的純度為(95.16±2.11)%，LAP-CD4+T細(xì)胞純度為(96.33±2.28)%。見圖1。免疫磁珠分選技術(shù)可獲得較高純度的目的細(xì)胞，可用于下一步功能鑒定實驗。

2.2 免疫磁珠分選的細(xì)胞活性CD4+T細(xì)胞分選前的細(xì)胞活性為(95.28±1.17)%，經(jīng)免疫磁珠兩步法分選后獲得的LAP+CD4+T細(xì)胞活性為(93.64±1.33)%，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.021，P=0.172)。LAP-CD4+T細(xì)胞活性為(94.05±1.41)%，與分選前的CD4+T細(xì)胞活性相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.339，P=0.189)。臺盼藍(lán)染色實驗結(jié)果提示細(xì)胞在分選前后均保持良好的活性，免疫磁珠分選過程不影響細(xì)胞的活性。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果LAP+CD4+T細(xì)胞單獨培養(yǎng)OD值為0.35±0.14，LAP-CD4+T細(xì)胞單獨培養(yǎng)OD值為0.79±0.22，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.631，P=0.000)；提示LAP+CD4+T細(xì)胞具有免疫無反應(yīng)性。與LAP+CD4+T細(xì)胞單獨培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)OD值為0.39±0.18，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.914，P=0.000)；提示LAP+CD4+T細(xì)胞對LAP-CD4+T細(xì)胞有明顯抑制作用。

2.4LAP+CD4+T細(xì)胞因子IL-10和TGF-β表達(dá)比較ELISA檢測結(jié)果顯示LAP+CD4+T細(xì)胞高表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子，IL-10和TGF-β分別為(149.32±22.68)、(182.22±63.44)ng/mL，LAP-CD4+T細(xì)胞高表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子，IL-10和TGF-β分別為(78.52±22.38)、(113.83±29.96)ng/mL，二者同一指標(biāo)比較，P均<0.05。

3 討論

潛在性相關(guān)多肽[7]是一種能與TGF-β非共價結(jié)合的前肽，其結(jié)合于TGF-β的氨基末端并形成小的潛在TGF-β復(fù)合物。目前在小鼠模型及健康人體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合型TGF-β和分泌型TGF-β，體外研究實驗[6]表明Treg細(xì)胞的分化及免疫抑制功能與TGF-β緊密相關(guān)。2010年Grandhi等[8]發(fā)現(xiàn)在健康人外周血中存在LAP+CD4+Treg細(xì)胞，這些細(xì)胞具有低增殖性且缺乏Foxp3，能分泌IL-8、IL-9、IL-10及干擾素-γ，其免疫抑制活性依賴TGF-β和IL-10。IL-10是一種重要的抗炎因子，能分泌跨膜受體復(fù)合物，調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的功能活性,進(jìn)而減少炎性介質(zhì)的釋放，抑制炎性細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)而緩解急慢性炎癥癥狀[12]。最近研究[9,10]表明，IL-10能不同程度地抑制CD4+T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子合成，且與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)。TGF-β對細(xì)胞的生長分化及機體免疫功能的調(diào)節(jié)均有重要作用，可能通過以下機制促進(jìn)腫瘤生長：一方面TGF-β能抑制中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫性細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而抑制免疫細(xì)胞的增殖、分化及其活化[11]；另一方面TGF-β通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK)促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管的生成繼而促進(jìn)腫瘤在體內(nèi)的生長[12]。

LAP+CD4+T細(xì)胞作為一種新近發(fā)現(xiàn)的Treg細(xì)胞亞群在疾病中的作用受到越來越多的關(guān)注。現(xiàn)有研究[13,14]證明，LAP+CD4+T細(xì)胞能緩解紅斑狼瘡、糖尿病等自身炎性疾病動物模型的癥狀。Mahalingam等[15]研究發(fā)現(xiàn)CRC患者腫瘤組織中LAP+CD4+T細(xì)胞明顯高于癌旁組織；該細(xì)胞易于富集到腫瘤組織中，可能參與了這里的免疫逃逸機制。這些細(xì)胞能高表達(dá)INF-γ、IL-17，相對低水平的IL-2及IL-10；對LAP-CD4+T細(xì)胞的抑制作用部分依賴TGF-β。因此想要進(jìn)一步揭示LAP+CD4+T細(xì)胞功能在自身免疫性疾病和腫瘤免疫機制中的作用，就需得到一群純度高、活力好的LAP+CD4+T細(xì)胞來研究?，F(xiàn)今，分離LAP+CD4+T細(xì)胞主要方式有流式細(xì)胞分選法和免疫磁珠分選法，流式細(xì)胞分選法由于對實驗儀器設(shè)備要求高且操作復(fù)雜成本較高，不適合廣泛推廣。而基于免疫吸附原理的免疫磁珠分選法具有高效、快速、操作簡單的優(yōu)點，短時間內(nèi)能獲取高純度的LAP+CD4+T細(xì)胞。本實驗采用免疫磁珠法從結(jié)直腸癌患者外周血中分離出來的CD4+T細(xì)胞純度為(95.16±2.11)%，LAP-CD4+T細(xì)胞純度為(96.33±2.28)%，臺盼藍(lán)染色實驗顯示分選后細(xì)胞活性較分選前細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明免疫磁珠法分離LAP+CD4+T細(xì)胞對細(xì)胞活性影響很小，能滿足下一步實驗研究需要。ELISA實驗結(jié)果顯示，LAP+CD4+T細(xì)胞與LAP-CD4+T細(xì)胞比較，前者分泌較多TGF-β和IL-10，此與Grandhi等[8]有關(guān)LAP+CD4+T細(xì)胞的體外細(xì)胞因子譜的表達(dá)結(jié)果相似；說明LAP+CD4+T細(xì)胞有可能通過分泌大量免疫抑制因子繼而抑制宿主對腫瘤的免疫應(yīng)答，另外LAP+CD4+T細(xì)胞單獨培養(yǎng)OD值明顯低于LAP-CD4+T細(xì)胞單獨培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；說明LAP+CD4+T細(xì)胞具有較低的免疫反應(yīng)性；混合培養(yǎng)OD值相較于LAP+CD4+T細(xì)胞單獨培養(yǎng)的OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義；說明LAP+CD4+T細(xì)胞對LAP-CD4+T細(xì)胞有明顯抑制作用，這與Mahalingam等[15]關(guān)于LAP+CD4+T細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織微環(huán)境中比例的研究結(jié)果相似，其具體機制可能與LAP+CD4+T細(xì)胞能分泌高濃度細(xì)胞免疫抑制因子TGF-β及IL-17有關(guān)，但其具體機制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，免疫磁珠法分選細(xì)胞設(shè)備簡便，價格低廉，操作過程簡單快速，在短時間內(nèi)可獲得高純度及高存活率細(xì)胞，且無需特殊處理即可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀分析檢測等相關(guān)實驗研究。因此，免疫磁珠分選技術(shù)是分選LAP+CD4+T細(xì)胞的有效方法，有良好應(yīng)用前景。

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Isolation, purification and functional identification of LAP+CD4+regulatory T cells from human peripheral blood of patients with colorectal carcinoma

YANGZuqing,JIANGZhiyuan,ZHONGWu,WANGShijun,CAOYunfei

(FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore a method for isolating and purifying LAP+CD4+regulatory T (LAP+CD4+T) cells from human peripheral blood of patients with colorectal carcinoma (CRC) by magnetic activated cell sorting (MACS) and to investigate the function of these T cells in vitro. Methods LAP+CD4+T cells were isolated by MACS two-step method (negative sorting and positive sorting). The purity and the survival of these T cells were identified by flow cytometry (FACS) and Typan blue staining. The inhibition effect of LAP+CD4+T cells on the proliferation of LAP-CD4+T cells was determined by CCK-8. The expression of IL-10 and TGF-β was measured by ELISA.Results The purity of LAP+CD4+T cells isolated by MACS was 95.16%±2.11%. The cell viability was 93.64%±1.33%. The proliferation of LAP-CD4+T was obviously inhibited by intervention of LAP+CD4+T cells. The suppressor cytokine, TGF-β and IL-10, which were secreted by LAP+CD4+T cells was more than that of LAP-CD4+T cells.Conclusion MACS used for isolating LAP+CD4+T cells from peripheral blood of patients withe CRC has advantages of high efficiency, high speed, and high purity and no damage to cell activity.

colorectal carcinoma; magnetic activated cell sorting; LAP+CD4+regulatory T cells

國家自然科學(xué)基金資助項目(81250316)。

陽祖慶(1989-)，男，碩士在讀，主要研究方向為結(jié)直腸癌發(fā)病機制的基礎(chǔ)研究。E-mail：290572913@qq.com

簡介：曹云飛(1971-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為結(jié)直腸癌發(fā)病機制的基礎(chǔ)研究。E-mail：caoyunfei126@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.007

R735.3

A

1002-266X(2016)41-0026-04

2016-07-10)