侯 磊?。ㄉ綎|省泰安市畜牧獸醫(yī)局　271000）

冷凍保存技術(shù)在動物遺傳資源保護策略中的潛力

侯 磊（山東省泰安市畜牧獸醫(yī)局271000）

通過冷凍保存技術(shù)對家畜的遺傳物質(zhì)進行異位保護是對這些物種遺傳多樣性保護的一種重要策略。冷凍保存技術(shù)的發(fā)展有助于保護策略的完善，不同物種遺傳物質(zhì)類型的選擇取決于保護目標(biāo)、技術(shù)可行性（如收集、冷凍保存）、成本和實際環(huán)境。

目前，家畜全球多樣性正日益受到威脅。在世界范圍內(nèi)，大量家畜品種處于極危狀態(tài)，有的品種已經(jīng)滅絕。在6379個家畜品種中，處于極危狀態(tài)的占9%，處于瀕危狀態(tài)的則占到了39% 。家畜遺傳多樣性的下降并亟待保護已在全世界達成共識。（1）為了滿足不斷變化的消費以及育種和選擇的要求，家畜品種內(nèi)和品種間多樣性的保護同樣重要。在稀有或瀕危品種小的有效保種群體中，必須監(jiān)測并制定計劃以維持品種間多樣性。盡管目前地方品種和商用品種間特異性狀的漸滲雜交還十分有限，Notter就已提出：與植物一樣，低產(chǎn)品種中也可能存在有用基因，并推薦了應(yīng)用于遺傳資源評價、保護和利用的系統(tǒng)計劃。遺傳多樣性的保護有多種選擇?？偟膩碚f，作為一種品種保護機制，原位保護或通過利用加以保護是首選，因為一個品種必須進化才能適應(yīng)不斷變化的環(huán)境，豐富的遺傳多樣性才能滿足推出新產(chǎn)品的要求，理想的保種策略應(yīng)保護有發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用價值的種質(zhì)資源。除了原位保護，還建立了一些技術(shù)或方法來保護稀有品種和應(yīng)用較廣的商業(yè)品種。這些方法或技術(shù)有的是在生產(chǎn)外維持一定數(shù)目的活體，有的是在他們的自然環(huán)境之外的地方維持一定數(shù)目的活體（異位活體），有的則是通過生殖質(zhì)進行異位保護。對保存現(xiàn)有等位基因多樣性供將來應(yīng)用來說，生殖質(zhì)的冷凍保存是一種很好的異位保護策略。（2）異位保護策略能滿足多種目標(biāo)需求，逐漸引起人們更多的關(guān)注。異位保護可代表保護的整體構(gòu)成，有的策略主要集中在稀有品種生殖質(zhì)的保存上，但總體來說在異位保護樣品收集上達成了這樣的共識：為了在保護中獲得盡可能多的等位基因或遺傳多樣性，應(yīng)該收集所有品種的樣品。當(dāng)動物遺傳資源的原位保護或利用不依賴高科技方法或設(shè)備時，異位保護的效率和效能就必然得益于冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。由于異位保護成本相當(dāng)昂貴，對冷凍保存技術(shù)的優(yōu)先次序、不同方法、未來應(yīng)用和好處上仍存在爭論。

本文在綜述了家畜冷凍保存最新技術(shù)狀態(tài)后，討論了異位保護策略的實質(zhì)。

1　冷凍保存技術(shù)狀態(tài)

1.1低溫生物學(xué)原理（1）低溫生物學(xué)在上世紀下半葉取得了重大進展，大多是由實驗研究獲得。冷凍保存允許生物材料在幾千年或更長的時間內(nèi)不變質(zhì)。近幾年，冷凍生物學(xué)基礎(chǔ)理論的發(fā)展極大地推動了學(xué)科的發(fā)展。（2）在被稱為“慢速冷卻”的方法中，生物材料以一定的速率范圍冷卻，該范圍內(nèi)，冷卻速率既可避免慢速冷卻損傷，但同時又足夠慢，使細胞進行充分地脫水，防止細胞內(nèi)冰晶的形成。留在冰晶中未冷凍片斷中的脫水細胞最終達到穩(wěn)定的玻璃化狀態(tài)，或稱“玻璃化”。在這種稱為玻璃化的方法中，通過在冷凍前加入高濃度的抗凍劑降低細胞中水的含量，因此，一點冰晶也無法形成，整個樣品呈玻璃化狀態(tài)。這使得較快冷凍速率下，也不會出現(xiàn)危險。較高的冷卻/解凍速率可使玻璃化溶液中抗凍劑的濃度最低。極高的冷卻速率下，即使不加抗凍劑也可完成玻璃化。

1.2精液（1）大多數(shù)家畜的精液可成功冷凍，而且對許多家禽、家畜已有專門的冷凍介質(zhì)和用于采集、分裝、冷凍和人工授精的設(shè)備，這些介質(zhì)和設(shè)備都可買到。已在牛的人工授精（AI）中進行了精液“耐凍性”選擇，解凍后的精液品質(zhì)相當(dāng)好，有活力的精子可達50%～70%，若提高輸精量，使用凍精獲得的妊娠率或產(chǎn)仔率可達到鮮精的水平。對其它的哺乳類家畜，總的來說解凍后頂體質(zhì)膜完整或有活力的精子百分率稍低，但對大多數(shù)物種而言，在精子成活力上差異不大。在許多動物中發(fā)現(xiàn)凍精的受精力要比鮮精差，這主要取決于輸精部位、雌性生殖道形態(tài)、鑒別發(fā)情或排卵的能力，綿羊凍精子宮頸輸精效果就比鮮精差很多，目前國外主要采用腹腔微創(chuàng)手術(shù)進行人工授精，受胎率能達到60%以上。精液耐凍性隨品種和公畜的不同顯出相當(dāng)大的差異，一些遺傳上特殊的品種或公畜冷凍精液也許就不適合作基因庫資源，利用效率較低。（2）在家禽上，精液冷凍技術(shù)在雞、火雞、鵝和鴨上呈現(xiàn)出相同的解凍后精子活力，活精子的比例可達到60%。已有用解凍精液在主要家禽品種中進行人工授精收到良好效果的報道。但正如Hammerstedt和Graham的文章所指出的，在卵子受精率的研究上，各報道有明顯的差異，結(jié)果從9%到91%不等。而且用冷凍精液在雞上達到最高受精水平所需的精子數(shù)要比使用鮮精時高許多。（3）緩沖液在不同綱間和同綱異種間存在巨大差異。大多數(shù)緩沖液具有鹽或糖的滲透性，緩沖液的適當(dāng)?shù)臐舛葟?.2～1.5mol/L不等。緩沖液中有眾多保護性大分子添加物，多數(shù)為牛奶或卵黃成分或是植物源性的脂質(zhì)成分。牛奶和卵黃主要添加到哺乳動物精液緩沖液中，這些大分子物質(zhì)在冷卻、冰凍和解凍時保護精子。（4）甘油作為一種適宜的抗凍劑廣泛應(yīng)用于哺乳動物和鳥類。但是在家禽中發(fā)現(xiàn)甘油可以避孕，因此家禽精液解凍后必須將甘油去除。不同物種所使用的抗凍劑差異很大，相同物種同一種抗凍劑在有的研究中效果很好，而在另一種研究中卻不適合。甘油在大多數(shù)哺乳動物中都有應(yīng)用。在家禽上，二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、DMA（二甲基乙酰胺）、DMP（NN-二甲酰胺）經(jīng)常用到。（5）精液一般通過“慢速冷卻”法進行冷凍保存，研究發(fā)現(xiàn)最優(yōu)冷卻速率大多集中在10～100/min℃的范圍內(nèi)。在一定程度上，報道中的差異可能跟抗凍劑的種類和濃度有關(guān)。一個極端的例子就是當(dāng)雞的精液用二甲基乙酰胺而不是甘油作抗凍劑時，冷卻速率在600/min℃效果最好。細胞膜對不同抗凍劑的通透性變化較大，同時抗凍劑也影響膜對水的通透性。這些參數(shù)不僅影響了細胞的脫水速率，也影響最優(yōu)冷卻速率。

1.3卵母細胞過去的十年中，卵母細胞冷凍技術(shù)得到了巨大發(fā)展。已有許多動物卵母細胞解凍后成熟、受精和胚胎發(fā)育成功的報道。在牛、鼠、大鼠、馬和人上已有利用冷凍保存的卵母細胞產(chǎn)生胚胎并最終獲得成活胎兒的報道，但其效率和可靠性仍遠遠低于冷凍胚胎。在家禽和魚上卵母細胞的冷凍保存未獲成功。這是由于鳥類和魚類卵母細胞體積較大，脂類含量較高以及其兩極構(gòu)造（動物極和植物極）。

1.4胚胎或胚胎細胞牛胚胎的冷凍保存非常成功，慢速冷凍和玻璃化方法都很有效。冷凍保存的成功依賴于胚胎所處的時期，如囊胚的凍存效果特別好。在重要家畜種類上已有利用凍存的胚胎獲得成活后代的報道。豬胚胎的冷凍保存一直是個難題，這主要是因為豬胚胎的冷敏感性和它較高的脂類含量。近期的研究主要集中在解決這些問題以及尋找能在豬胚胎冷凍保存中成功應(yīng)用的玻璃化方法上。

1.5體細胞多種類型體細胞的冷凍保存已被實驗證明是可行的。早期研究發(fā)現(xiàn)，加入5%～10%適宜的抗凍劑如甘油、DMSG到培養(yǎng)基細胞懸液中，將帶幾毫升懸液的培養(yǎng)管放到-80℃冷凍設(shè)備中保存，該方法目前仍然在有效利用。但是用這種簡單方法不能控制冷卻速率，事實上在很多文章中冷卻速率都是不可控的，只有皮膚成纖維細胞等很少的研究中使用了控溫冷凍設(shè)備。

1.6進展（1）對低溫生物學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域的更多關(guān)注將使冷凍保存方法獲得更大發(fā)展。一種基礎(chǔ)方法已廣泛應(yīng)用于有關(guān)哺乳動物精液和胚胎的研究中，但卻較少應(yīng)用于魚類和魚類精液研究。最近提出了一種估計適用于“慢速冷卻”冷凍方法最優(yōu)程序的理論模型。這一模型表明非線性冷卻圖要比線性圖的冷卻程序效果更好。與其它模型一樣，該模型也證明最優(yōu)冷卻速率可與抗凍劑濃度互相影響，這也在實驗研究中發(fā)現(xiàn)過，因此在最優(yōu)實驗研究中確定這兩個因素很重要。改善冷凍方法可提高冷凍的整體水平，即使用較差冷凍設(shè)備處理的精子也能夠獲得足夠的解凍后活力。（2）對精子玻璃化的嘗試尚未成功。最近表明在沒有抗凍劑下利用極高的冷卻速度（72000/min）℃，有可能使人的精子玻璃化，只有這種條件下，才能避免由于抗凍劑的存在所造成的損壞、凍傷和冰晶的形成。玻璃化技術(shù)的進一步完善對冷敏感細胞的冷凍特別重要：例如克服第二次減數(shù)分裂中期卵母細胞紡錘體微管解聚效應(yīng)。極高的冷卻速率可應(yīng)用于開放式拉長冷凍細管技術(shù)，也可通過使用冷凍環(huán)加以應(yīng)用。由于解凍后紡錘體仍能恢復(fù)正常的形態(tài)和功能，即使在慢速冷凍過程中被打斷仍可獲得較好的冷凍效果。

2　異位保護策略的影響

（1）保存材料種類的選擇和采樣策略取決于保護計劃的目的。根據(jù)材料類型、冷凍保存技術(shù)的可行性、成本和實際環(huán)境不同，所做的選擇也會不同?？偟膩碚f，冷凍保存和相關(guān)的繁殖技術(shù)成本都很昂貴。異位保護廣泛發(fā)展的主要限制因素是收集成本昂貴，保存的物質(zhì)應(yīng)用有限。采樣、收集、冷凍、保存和遺傳材料利用的成本存在種間差異，最佳的策略取決于當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，技術(shù)能力和人工設(shè)備成本。Gandini和Pizzi查閱了有關(guān)保護成本的文獻，并得出了結(jié)論：有關(guān)異位保護成本的文獻有限，也不及時。Labroue計算了在歐洲4個國家建立精液保存庫的成本，每個品種大約30000歐元（Euro），單位劑量15歐元。考慮到人工費用、實驗費用和基礎(chǔ)費用，假定冷凍能力在每天6次射精量上，在荷蘭進行豬精液冷凍保存的成本估計為10歐元/劑量。精液由AI中心到貯存處的運費和精液收集的費用未考慮。（2）荷蘭遺傳資源中心（CGN）的實驗表明：不同物種精液收集和冷凍的成本，在單位劑量少于1歐元（牛）到多于20歐元（綿羊和家禽）不等。綿羊和家禽較高的成本是由單位劑量過高的操作，培訓(xùn)和冷凍成本以及缺乏這些物種AI基礎(chǔ)設(shè)施造成的。CGN得出了實驗結(jié)論：在綿羊品種遺傳多樣性保護中，作為射精后精液收集和冷凍的一種備選，收集和冷凍淘汰公羊附睪精液是一種低投入高產(chǎn)出的方法。（3）物種間世代間隔和繁殖率的差異也可能影響保護計劃的制定。與其它物種相比，一些物種可以用便宜而簡單的方法快速繁殖一代，例如在魚中用保存的精液通過回交再生一個滅絕的物種是可行的，這是因為魚類有較短的世代間隔和較高的年周轉(zhuǎn)量，相反，同樣的策略應(yīng)用于牛或馬則不僅費時還相當(dāng)昂貴，在這些物種中胚胎凍存比精液更適合。（4）胚胎收集和冷凍成本要遠遠高于精液，但利用胚胎再生的成本遠遠低于利用精液（重復(fù)回交）再生的成本。雖然許多保護計劃只注重精液凍存，考慮到回交重建一個品種時線粒體DNA的丟失和時間上的滯后，如果僅出于品種保護的目的，那胚胎收集和凍存的作用就被低估了。在這種情況下，即使克隆的效率有相當(dāng)大的提高，體細胞的冷凍保存也無法替代胚胎冷凍保存。體細胞凍存的前期成本可能很低，但其線粒體DNA卻無法保存，并且隨后的生殖克隆在效率上無法與胚胎的凍存和移植相比。精液和卵母細胞的貯存在樣品采集和冷凍成本上具有成本優(yōu)勢，但是體外受精和卵收集的成本較高。估計用胚胎代替精液和卵母細胞的總體成本仍會偏高。（5）當(dāng)材料在冷凍/解凍后的存活率升高，妊娠率也增加時，繁殖足夠后代所需的基因庫遺傳材料就會減少，因而基因庫材料中采樣和冷凍上的成本就會降低。此外，如果遺傳上重要公畜精液的耐凍性能顯著提高時采樣成本就能進一步降低。矛盾的是，冷凍保存的使用會造成遺傳多樣性的降低，但同時應(yīng)用于保護計劃時又是有利的，例如在荷蘭黑白花奶牛中結(jié)合使用遺傳評定、AI、冷凍精液和最近出現(xiàn)的其它繁殖技術(shù)后獲得了較高的遺傳進展，促進了荷蘭黑白花奶牛以地方奶牛品種的成本在世界范圍內(nèi)更大規(guī)模地利用，由此也降低了荷蘭黑白花奶牛有效（保種）群體的規(guī)模。作為一種副效應(yīng)，有關(guān)牛冷凍精液、AI和其它繁殖技術(shù)的知識最終對多個畜種的品種保護發(fā)揮了重要作用。

3　結(jié)論

（1）在以保護品種為目的的異位保護中，胚胎收集和冷凍保存的作用被低估了，應(yīng)給予更多關(guān)注。（2）冷凍保存技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)并將繼續(xù)提高保護計劃的效率和效能。（3）冷凍保存技術(shù)在其它物種上的發(fā)展有助于這些技術(shù)在欠發(fā)達物種上的發(fā)展。（4）保護計劃的決策者應(yīng)定期重新考慮目標(biāo)成本、技術(shù)可行性和實用性之間的平衡。

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S813.11文獻標(biāo)識碼：A

1007-1733（2016）08-0084-03

泰安市科技發(fā)展計劃（201420774-20b）

2016-06-07）