馮繻億，吳麗娟

(四川藏寶蟲草生物科技有限公司，四川 雙流 610200)

?

全人工培育冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究

馮繻億，吳麗娟

(四川藏寶蟲草生物科技有限公司，四川 雙流 610200)

摘要：系統(tǒng)闡述了冬蟲夏草從菌種、蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)、幼蟲侵染及僵蟲出草培育等方面的全人工培育的技術(shù)要點。

關(guān)鍵詞：冬蟲夏草；菌種；蝙蝠蛾幼蟲；侵染；全人工培育

冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)又名蟲草，是傳統(tǒng)中醫(yī)藥學上常用的名貴中藥材，具有較高的滋補功效。蟲草首先是由蟲草屬冬蟲夏草菌侵入高山草甸土壤中的蝙蝠蛾幼蟲體內(nèi)，然后冬蟲夏草菌生長發(fā)育消耗蟲體營養(yǎng)，使幼蟲軀體逐漸僵化，在夏季的適宜條件下，冬蟲夏草菌從僵蟲的頭端抽生出長棒狀的子座進而形成蟲草，其本質(zhì)是冬蟲夏草菌的子實體與僵蟲菌核(幼蟲尸體)構(gòu)成的復合體。冬蟲夏草主要產(chǎn)于中國青海、西藏、四川、云南、甘肅和貴州等省及自治區(qū)的高寒地帶和雪山草原[1]。

《現(xiàn)代實用中藥》中記載，冬蟲夏草適用于肺結(jié)核、老人衰弱之慢性咳嗽氣喘，吐血、盜汗、自汗；又用于貧血虛弱，陽痿遺精，老人畏寒，涕多淚出等證。由于冬蟲夏草有多種功效及保健作用，受到廣大消費者親睞。

近些年，由于消費需求增加，導致過度采挖、草原資源破壞，野生冬蟲夏草產(chǎn)量減少。從上世紀80年代到現(xiàn)在，有許多研究者投入冬蟲夏草的人工培育，在菌種、蝙蝠蛾幼蟲養(yǎng)殖、侵染等方面獲得單點式的突破，但一直未能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)就本研究組通過多年對人工培育冬蟲夏草研究，在成都平原(海拔約500m、年平均氣溫16.7℃)進行中試取得一定的突破后，總結(jié)出以下經(jīng)驗及其技術(shù)要點。

1菌種

1.1菌種分離鑒定

冬蟲夏草菌屬于子囊菌門，麥角菌科(Clavicipifaceae)，蟲草屬[Cordyceps( Fr) Link]。實現(xiàn)人工培育冬蟲夏草，首要技術(shù)為菌種方面，正確的菌株侵染蝙蝠蛾幼蟲才能獲得冬蟲夏草。郭英蘭(1989)[2]的研究表明，可以利用組織分離和子囊孢子分離的方法獲得冬蟲夏草菌的無性世代，同時提供了從形態(tài)上辨別中國被毛孢的方法；郭英蘭(2006)[3]利用現(xiàn)代分子手段，證實了中國被毛孢是冬蟲夏草菌的無性世代。

1.2菌種的篩選

冬蟲夏草菌的分離方法雖容易，但由于不明確冬蟲夏草菌為同宗或異宗雜交，因此，很難篩選出侵染后能出草的菌株。目前一些研究者試圖利用分子手段(姚一建)[4]研究冬蟲夏草菌株間的雜交關(guān)系，從基因上篩選菌株。本研究組用組織分離方法獲得冬蟲夏草菌無性世代后，通過中國微生物研究所檢驗，證實為中國被毛孢；為進一步探究該菌株的特性，將其放置低溫、變溫或者紫外燈照射的條件下，刺激產(chǎn)生子實體，確定所選菌株具備產(chǎn)生子座的能力，才用作侵染菌株。

2蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)

2.1飼料選擇及飼養(yǎng)條件

冬蟲夏草菌的寄主為蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲，該幼蟲在自然環(huán)境(海拔3500～5000m)下完成一個世代周期需要2～5年時間，這是對實現(xiàn)蟲草人工培育的一大障礙。因此，人工培育冬蟲夏草的重要條件是人工培育蝙蝠蛾幼蟲。陳仕江(2001)在對西藏那曲冬蟲夏草的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，蝙蝠蛾幼蟲具有雜食性、耐澇性、耐寒性、耐饑性等生態(tài)習性，高山嵩草、圓穗蓼、青藏苔草是蝙蝠蛾幼蟲喜愛的飼料，且多數(shù)生活在高山草甸土和亞高山草甸土中，有機質(zhì)含量豐富。因此，在人工飼養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲過程中模擬高山草甸環(huán)境很重要，關(guān)鍵在于飼料及有機質(zhì)含量多的腐殖土的選擇。王忠(2001)[5]的研究中，選擇用胡蘿卜作為幼蟲的飼料；在工廠化飼料幼蟲時，采用胡蘿卜作為飼料，不僅符合幼蟲的適口性，而且經(jīng)濟成本低。王宏生(2002)[6]的研究表明，利用半人工飼料喂養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲的最佳飼料配方為：大小黃、山梨酸、黃豆、酵母粉、玉米粉、麥麩、瓊脂、水。陳士林(2012)[7]研究發(fā)現(xiàn)，采用高山珠芽蓼為幼蟲飼料，成功完成全人工飼養(yǎng)，且能進行世代循環(huán)。周祖基、葉萌、代勇在研究人工飼養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲時發(fā)現(xiàn)，混合飼料更有利于幼蟲的生長，并申請專利《用于飼養(yǎng)冬蟲夏草寄主幼蟲的飼料和飼養(yǎng)寄主幼蟲的方法》。張德利(2013)[8]在研究中建議，在飼養(yǎng)過程中可以考慮在前期及中期使用腐殖土和沙土混合作為幼蟲的基質(zhì)，后期使用純沙的基質(zhì)來飼養(yǎng)幼蟲，控制土壤含水量在40%～60%之間。

本研究組總結(jié)自身多年試驗的結(jié)果，綜合前人研究成果，模擬高山草甸環(huán)境于成都平原飼養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲，用腐殖土做基質(zhì)，水分調(diào)節(jié)到50%，采用以胡蘿卜為主，珠芽蓼、圓穗蓼、蕨麻為輔的混合飼料，目前在成都平原地區(qū)進行產(chǎn)業(yè)化室內(nèi)養(yǎng)殖取得突破，其養(yǎng)殖關(guān)鍵在于養(yǎng)蟲基質(zhì)和幼蟲飼料以及幼蟲生長的微環(huán)境控制。

2.2蝙蝠蛾幼蟲的世代循環(huán)養(yǎng)殖

全人工培育冬蟲夏草，在蝙蝠蛾的養(yǎng)殖中世代循環(huán)為重要議題，實際生產(chǎn)時可能出現(xiàn)第二代蟲已經(jīng)孵化，但第一代蟲還在蛹期，因此世代循環(huán)需要掌握二代蛹的養(yǎng)護與羽化技術(shù)。經(jīng)觀察研究發(fā)現(xiàn)，二代蛹存在羽化率降低及化蛹時間不同步的現(xiàn)象，與陳士林(2012)研究中小金蝠蛾時所觀察相同，會導致二代蟲交尾率下降，不利維持族群數(shù)量。這時可根據(jù)實際情況采用激素、溫差、饑餓刺激，使同一時間化蛹數(shù)量增加。因此，在蝙蝠蛾幼蟲的飼養(yǎng)后期要多注意觀察，及時揀出蛹，并保持低溫，建議為5℃，待群體數(shù)量足夠大時，才進行集中羽化。羽化交尾時間不整齊時，分日收集之卵也需要恒溫保存，且卵的保存需注意保濕。

2.3蟲室的污染及其控制

冬蟲夏草寄主幼蟲的養(yǎng)殖方法包括野外大棚草地放養(yǎng)、室內(nèi)蟲盒養(yǎng)殖兩大方式，各有科研單位施行，然而兩種飼養(yǎng)方式優(yōu)劣并未有定論。本研究組考慮產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖可行性，采用室內(nèi)蟲盒養(yǎng)殖，經(jīng)過大量養(yǎng)殖試驗中，發(fā)現(xiàn)以下問題：養(yǎng)蟲盒中所裝腐殖土營養(yǎng)成分高，且因幼蟲糞便積累等各種原因，后期蟲室易發(fā)生螨蟲危害，土壤螨蟲不會直接傷害幼蟲，但是會傳播病原菌如擬青霉、白僵菌及綠僵菌，高致病性的病原菌會不分時期感染幼蟲，使其迅速僵化死亡；后期由于僵蟲的出現(xiàn)，土壤中節(jié)肢動物(如螨蟲等)啃食僵蟲，直接導致出草率減少。由于本公司在全程養(yǎng)殖中不使用任何化學藥劑防治有害病原菌及害蟲，故蟲室的污染以管理為主要控制手段。例如：在飼養(yǎng)幼蟲時，應極其注意衛(wèi)生，在飼養(yǎng)幼蟲之前，蟲室應先進行熏蒸消毒作業(yè)，養(yǎng)殖過程中物料(如飼料)進入蟲室時應先消毒，基質(zhì)(腐殖土)應先暴曬，再進行常規(guī)高溫高壓滅菌后方可進入蟲室。除此以外，養(yǎng)殖過程中人員管理方面：應注意個人衛(wèi)生，蟲室養(yǎng)護人員應依食品GMP穿著要求；操作時著重防止交叉污染。

3侵染

在全人工培育冬蟲夏草中，最關(guān)鍵的技術(shù)操作是幼蟲的侵染。在野生自然環(huán)境下，蝙蝠蛾幼蟲的侵染率極低。目前，關(guān)于冬蟲夏草菌感染蝙蝠蛾幼蟲的感染機理，尚未見有公認的感染機制相關(guān)報道。因此，在研究全人工培育冬蟲夏草中，所采用侵染的方式不一[9-10]，如有利用收集子囊孢子模擬野生環(huán)境侵染模式，也有利用無性孢子或菌絲進行拌土或拌飼料、噴淋等方法。

本研究組前期試驗中，采用改良的針刺侵染法進行侵染，侵染率普遍達到55%左右，最高甚至達90%以上，并將改良的侵染工具申請專利：《一種人工培養(yǎng)冬蟲夏草用針刺侵染裝置》。同時，也對拌入菌土或飼料的方法進行多次試驗，其侵染率約為10%。侵染操作其關(guān)鍵在于菌株的選擇、侵染菌株預處理等步驟。

4出草

人工培育冬蟲夏草的最后一個環(huán)節(jié)為僵蟲出草。涂永勤(2010)[11]的研究表明，子實體分化與形成需要4℃左右低溫刺激,變溫有利于子實體的形成;同時發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子對冬蟲夏草子實體形成及伸展具有重要作用。根據(jù)本研究組觀察，不同菌株不同蝙蝠蛾出草條件并不相同，綜合本研究組經(jīng)驗，將出草程序定為4～20℃變溫程序，出草率為總幼蟲數(shù)的8%。

5討論

菌種、蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)、侵染、出草是全人工培育冬蟲夏草的4大環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)需要保質(zhì)保量完成，且各個技術(shù)要點有效結(jié)合，才能完成人工培育冬蟲夏草的整個過程。除了這些大的方面，其中還有一些小細節(jié)需要結(jié)合實際的生產(chǎn)線來進行規(guī)劃和調(diào)整。例如：土壤濕度的調(diào)整，每個養(yǎng)蟲盒的情況不一樣，因此需要根據(jù)實際的情況形成可操作的標準作業(yè)流程；僵蟲的收集一般為每年的2月份，但有時會有推遲。因此要結(jié)合當年的情況，每月抽檢侵染率及了解侵染之蟲體內(nèi)菌生長的階段，以此判斷收集僵蟲的時間。

全人工培育冬蟲夏草進行產(chǎn)業(yè)化，是大勢所趨。以上提供之方法，是在成都平原地區(qū)進行中試規(guī)模后的觀察結(jié)果，希望為人工培育冬蟲夏草的擴大化養(yǎng)殖和產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]陳仕江,尹定華,丹增, 等.中國西藏那曲冬蟲夏草的生態(tài)調(diào)查[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報, 2001，8, 23(4): 289-293.

[2] 劉錫璉,郭英蘭,俞永信,等.冬蟲夏草菌無性階段的分離和鑒定[J].真菌學報,1989,8(1):35-40.

[3] 魏鑫麗,印象初,郭英蘭,等.冬蟲夏草及其相關(guān)類群的分子系統(tǒng)學分析[J]. 菌物學報,2006,25(2):192-202.

[4] Kathryn EB, Li Y, Wang W-J, 等.Isolation of theMAT1-1 mating type idiomorph and evidence for selfing in the Chinese medicinal fungusOphiocordycepssinensis[J].FungalBiology, 2013,117: 599-610.

[5]王忠,馬啟龍,喬正強,等.甘肅蟲草寄主昆蟲蝠蛾的全人工飼養(yǎng)技術(shù)[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,2001,(7):42-43.

[6]王宏生.冬蟲夏草蝙蝠蛾人工飼養(yǎng)技術(shù)的初步研究[J].昆蟲知識, 2002, 39(2): 144-146.

[7] 向麗,陳士林, 代勇，等.冬蟲夏草菌寄主小金蝠蛾人工飼養(yǎng)成蟲生物學特性[J]. 世界科學技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2012, 14(1):1172-1174.

[8] 張德利,劉飛,涂永勤，等.壤基質(zhì)與土壤含水量對蝙蝠蛾幼蟲生長發(fā)育的影響[J].農(nóng)學學報,2013,3(03):18-21.

[9] 王 忠,馬啟龍,喬正強,等.冬蟲夏草全人工培養(yǎng)感染試驗結(jié)果[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,2001,(7):40-41.

[10] 陳吉岳，曹永強，楊大榮.冬蟲夏草感染蝙蝠蛾幼蟲研究進展[J], 中國草地學報, 2010,32:41-42.

[11] 涂永勤,張德利,曾緯,等.蝠蛾屬幼蟲感染冬蟲夏草菌的實驗研究[J].食用菌,2010(3):16-17.