王霖蕾，姜宏衛(wèi)，馬瑜瑾，王　潔，范夢琳，黃　珂

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·綜述·

自噬在脂多糖炎癥模型與胰島β細胞凋亡中的作用

王霖蕾1,2，姜宏衛(wèi)1，馬瑜瑾1，王潔1，范夢琳1,2，黃珂1,2

摘要：目的了解自噬在炎癥性疾病中的作用研究進展，探索自噬對胰島β細胞的影響。方法檢索國內外已經發(fā)表的文獻，對脂多糖(LPS)誘導的急慢性炎癥模型的自噬及可能機制進行綜述，并針對糖尿病胰島炎癥中β細胞的自噬進行探討。結果LPS可誘導全身系統(tǒng)性炎癥反應，且伴隨自噬的變化。自噬在維持β細胞數量、結構及功能方面起重要作用。β細胞自噬缺陷是胰島炎癥向糖尿病發(fā)展中的一個重要因素。結論自噬在維持炎癥平衡和胰島β細胞凋亡的病理生理過程中起重要作用，自噬失衡可導致多種疾病。通過藥物調控自噬，可能是炎癥性疾病和糖尿病的新的治療策略。

關鍵詞：自噬；脂多糖；炎癥；糖尿?。灰葝uβ細胞；凋亡

2.河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南洛陽471003

隨著人們物質生活水平的提高，營養(yǎng)過剩導致的代謝性疾病發(fā)病率急劇增加，如肥胖和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)等，已成為世界范圍內的重大挑戰(zhàn)。慢性低度炎癥是肥胖和T2DM的特征，常伴有胰島β細胞功能不同程度的改變[1]。最近的研究表明自噬(autophagy)參與免疫應答和炎癥反應的調控[2]。而在多種疾病中，均伴有自噬的改變。自噬是在各種應激時細胞的一種保護機制，它可以降解胞內受損的細胞器和長壽命蛋白，以維持細胞的穩(wěn)態(tài)。本文回顧了自噬與系統(tǒng)性炎癥的相關資料，并針對其在胰島β細胞中的作用進行綜述。

1自噬的概念、功能及調控機制

1.1自噬和自噬流的概念自噬，簡而言之即“自己吃自己”，細胞可通過自噬，對受損的細胞器和異常的蛋白質等進行分解，并循環(huán)再利用[3-4]。自噬流即自噬的流程，是一個動態(tài)的過程。最常見的自噬現(xiàn)象為巨自噬，包括6個階段：起始階段、囊泡的初始化、延伸、終止、成熟和降解。細胞雙層膜包繞有待降解的物質而形成自噬小體，然后融合于溶酶體并降解其內容物[5]。其中，自噬小體膜狀結構的產生及底物清除是自噬流的兩個密切相關的過程。通常將LC3作為自噬的標記蛋白，并結合自噬底物P62綜合評估細胞自噬情況。

1.2自噬的功能及分子機制在細胞的多種生命活動中，自噬均發(fā)揮作用，調節(jié)細胞存活、維持內環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)。主要表現(xiàn)在以下幾方面[6-7]：①“求生”機制：饑餓、缺氧、DNA 損傷，當微生物感染時，在自噬作用下，細胞消化部分內容物以提供生命物質，對抗各種應激；②細胞穩(wěn)態(tài)的維持：自噬可調控胞內部分蛋白的表達，并可更新線粒體、內質網等；③參與部分組織的特異性融合過程；④細胞死亡的誘導：自噬在持續(xù)性激活狀態(tài)下，可以作為一種死亡程序，引起細胞死亡。自噬的起始階段需要兩個蛋白酶復合物：①ULK1/2-ATG13-FIP200；②Beclin1-Vps34-Vps15-ATG14。囊泡的形成同時依賴于上述兩種復合物[8]，Beclin1與PI3K、Vps34相關，導致PI3K相關蛋白的聚集，如DFCP1、WIPI等。而WIPI可識別PI3K在自噬小體的聚集，且在囊泡延伸復合物ATG12-ATG5-ATG16L1中是必需的[9]。囊泡閉合后其隨之與溶酶體結合，囊泡內的內容物即被降解。目前研究最多的自噬通路為mTOR信號通路，主要通過對Ulkl/2的磷酸化，抑制自噬體的形成。其上游調節(jié)信號通路為P13K/Akt途徑，可激活mTOR通路，導致自噬活性下降。自噬也可通過其他方式誘導，如AMPK、JNK-beclin1等，調控細胞代謝、凋亡、蛋白質分泌及細胞介導的炎癥反應。

2自噬與脂多糖炎癥模型

2.1LPS誘導的炎癥模型脂多糖(lipopoly saccharide,LPS)作為革蘭陰性菌菌壁成分，可以啟動炎癥，導致內毒素血癥。長期低劑量LPS干預，可以導致機體出現(xiàn)低度炎癥綜合征，如肥胖、糖尿病(diabetes mellitus, DM)、非酒精性脂肪肝和慢性炎癥性腸病[10-11]。在飲食因素中，如攝入過度的脂肪會引起循環(huán)中LPS升高，導致代謝性內毒素血癥，故高脂飲食被認為是血液中LPS增高的啟動因素[12]。因此，LPS被廣泛用于誘導炎癥。LPS炎癥模型的不同，其給藥方式及劑量亦不同。常見的給藥方式有腹腔給藥、皮下給藥、灌胃及靜脈注射給藥。腹腔注射后，因腸系膜靜脈系統(tǒng)吸收面積大、速度快，常用于制備急性LPS炎癥模型；LPS通過皮下微血管、淋巴管吸收入血，因皮下血管少，吸收速度慢，可用于制備慢性LPS炎癥模型；因灌胃給藥存在首過效應，會直接影響入血藥量；靜脈給藥，包括頸靜脈及尾靜脈注射，藥物直接入血，故可用于制備急性LPS炎癥模型。文獻報道在大鼠尾靜脈給藥，多采用5 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1給藥[13-16]，腹腔給藥劑量從1～10 mg·kg-1不等[17]，并且單次注射構建急性LPS炎癥模型。慢性炎癥模型的誘導，部分研究者采用5 mg·kg-1或10 mg·kg-1劑量單次腹腔給藥，分別給藥1個月、3個月、10個月[18-19]；有研究者用LPS 0.5 mg·kg-1，每3天1次，持續(xù)3個月[20]；Kitazawa等用LPS 0.5 mg·kg-1腹腔注射，每2周1次，持續(xù)6周構建慢性LPS炎癥模型[21]。因此，模型不同，給藥方式也不同，藥物劑量也千差萬別。

2.2自噬與LPS炎癥模型目前LPS誘導的炎癥涉及多個系統(tǒng)，包括神經、消化、呼吸、循環(huán)系統(tǒng)等，且伴自噬而變化。研究發(fā)現(xiàn)，10 mg·kg-1的LPS腹腔注射24 h后，腦組織中細胞因子IL-1β、IL-6等升高，自噬標志物Beclin1、LC3Ⅱ及p62下降；在3個月的慢性誘導，IL-1β呈中等分泌，Beclin1、LC3Ⅱ下降，而p62增高[20]；用LPS誘導動物急性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)腎臟皮質發(fā)生自噬，LC3Ⅱ隨LPS作用時間和劑量的增加而增加，并且Beclin1也升高[22]。研究表明LPS誘導的自噬對心肌細胞起保護作用，且Toll樣受體在此過程中起重要作用[23]。最新的研究提示ATG16L1與克隆氏病易感性相關，并證實其變異體結構的存在，提示細胞自噬與克隆氏病存在密切聯(lián)系[24-25]。在LPS誘導的急性肝損傷中，發(fā)現(xiàn)GFP-LC3熒光斑點的增加，提示有自噬現(xiàn)象的存在，但并未明確自噬在肝損傷中是一種代償機制還是負向調控[26]；龔清安等在LPS誘導的急性肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)Beclin-1表達增加，提示自噬能對肺損傷起一定的保護作用[27]。而在硅肺巨噬細胞中，LPS可能通過自噬小體的積累，加劇凋亡的發(fā)生[28]。

2.3自噬在LPS炎癥模型中的機制自噬對LPS炎癥的調控，可能通過以下幾個方面：①調控炎癥小體：自噬可作為炎癥小體的負向調控因子，囊泡延伸復合物中ATG16L1對自噬過程是必需的，其缺失可導致LPS刺激后IL-1β、IL-8的水平更高[29]。相反，自噬激活劑雷帕霉素誘導的自噬可導致IL-1β的降低[30]，自噬可直接包繞并降解炎癥小體和IL-1β，間接減少炎癥小體形成過程所產生的線粒體DNA、活性氧簇等。②自噬標志物P62可調控氧化應激：自噬除了可清除泛素化蛋白和細菌，在營養(yǎng)敏感通路中P62也參與氧化應激相關基因的上調[31]，尤其是抗氧化轉錄因子Nrf2調控的基因。正常生理條件下，Nrf2在胞質中與Keap1結合，氧化應激時P62競爭Nrf2結合位點。因此，p62-keap1復合物經自噬途徑降解，Nrf2活性增加，啟動下游抗氧化蛋白基因的轉錄，提高細胞抗氧化能力。③炎性介質的分泌：除傳統(tǒng)的分泌途徑外，也存在“自噬性分泌”炎癥介質，其涉及ATG蛋白及自噬過程[32]。據報道哺乳動物的“自噬分泌”有助于促炎因子IL-1β、IL-18的分泌，這個過程有賴于ATG5、自噬小體等的存在[33]。然而，關于炎癥與自噬的相互作用機制仍不十分明確，尚需進一步研究。

3自噬、炎癥與胰島β細胞

3.1T2DM胰島免疫細胞浸潤目前研究顯示T2DM人群中存在胰島炎，胰島周圍免疫細胞浸潤。Ehses等[34]研究了9個T2DM和7個正常人胰島中CD68細胞的分布，發(fā)現(xiàn)T2DM中胰島相關巨噬細胞數目更高，另外，CD68浸潤與胰島素活性下降、淀粉樣沉積增多有關。Richardson等[35]對15個T2DM和16個正常人胰腺樣本進行了CD68、胰島素染色，對545個DM胰島和564個正常人胰島的分析顯示DM胰島中CD68數目是后者的兩倍多。Marselli等[36]對DM樣本(23±9)個胰島和對照組(29±13)個胰島進行研究，發(fā)現(xiàn)兩者胰島內平均巨噬細胞數分別為(8.3±8.1)和(3.6±4.3)；此外，在1個DM、2個對照組胰腺樣本未顯示巨噬細胞浸潤。總體來說，糖尿病中胰島免疫細胞浸潤存在各種各樣的情況，甚至在同一樣本，炎細胞浸潤可能發(fā)生，也可能不發(fā)生。在Ⅰ型糖尿病中，胰島免疫細胞也存在多樣性，胰島中僅有20%～30%的胰島素，提示胰島炎的存在[37]。雖然導致胰島免疫細胞浸潤多樣性的因素機制不詳，但仍可反應β細胞的功能狀態(tài)但不影響β細胞的功能檢測。

3.2自噬與胰島β細胞在胰島β細胞數量和功能的維持方面，自噬具有重要作用。Atg7在自噬小體的形成中是極為重要的，β細胞特異性Atg7基因缺失小鼠出現(xiàn)高血糖、糖耐受不良，血胰島素水平較對照組偏低，提示在Atg7基因缺失小鼠，胰島素不足以代償糖耐受不良。并且，觀察到β細胞數量減少、死亡細胞增加、β細胞增殖減少、胰島素釋放減少等現(xiàn)象[38]。最近研究顯示β細胞特異性Atg7基因缺失小鼠與ob/ob肥胖小鼠雜交后，發(fā)生了嚴重的糖尿病，提示自噬缺陷的胰島β細胞可以代償基礎的代謝應激，卻無法代償肥胖所致的代謝應激[39]。因此，β細胞自噬缺陷是肥胖向糖尿病進展中的一個重要因素。Marselli等[36]研究發(fā)現(xiàn)ATG3、ATG7、Beclin-1在胰島內有不同程度的表達，電鏡下糖尿病胰腺組織中發(fā)現(xiàn)大量死亡的β細胞內可見空泡樣改變，不伴隨核的改變，提示應為自噬相關的細胞死亡；在分離胰島組織評估其基因表達，涉及自噬前期階段的Beclin1與Atg1沒有改變，自噬晚期階段LAMP-2轉錄下降。這些提示自噬的缺陷/受損與β細胞功能的失調有關。與其他多種器官不同，C57BL/6小鼠過夜禁食后不會誘導β細胞自噬，而胰島分離后體外饑餓會導致很小的自噬囊泡的積累，其直徑<0.5 μm，與C57BL/6小鼠標準飲食喂養(yǎng)結果一致。但在高脂飲食喂養(yǎng)下，可觀察到較大的自噬小體積累，直徑在0.5～2 μm，即自噬被誘導。持續(xù)的暴露于各種各樣的應激中，如糖脂毒性、氧化應激等，胰島β細胞具有高分泌活性[40]，但胰島β細胞是如何應對各種應激，其中自噬機制及其與其他組織有何不同，仍有待進一步研究。

3.3自噬、炎癥與胰島β細胞在炎癥介質中，如細胞因子在糖尿病β細胞死亡過程中起重要作用，導致β細胞凋亡[41]。自噬與凋亡之間存在聯(lián)系[42]，例如：P62調控蛋白質和細胞器降解，并與幾個促凋亡、抗凋亡分子存在相互作用。此外Beclin-1與Bcl-2聯(lián)系密切，在促凋亡蛋白BH3作用下，由于Beclin-1的釋放，自噬即被啟動，而Bcl-2、Bcl-XL過表達可抑制自噬。炎性細胞因子暴露引起β細胞凋亡增加，胰島素分泌指數下降，加入伊馬替尼誘導自噬后，β細胞凋亡數目明顯減少，并保留胰島分泌能力，這些提示β細胞凋亡減少與自噬增強有關[36]。因此，推測LPS干預可誘導胰腺炎癥，損傷胰島細胞，其中自噬可能發(fā)揮重要作用。

4總結

總之，糖尿病胰島β細胞存在自噬機制，其在胰島β細胞凋亡的病理生理過程中起重要作用。而且，自噬在維持炎癥平衡方面起重要作用，自噬失衡可導致多種疾病。鑒于胰島β細胞的特殊性，了解胰島炎癥與自噬間的關系和其機制，有助于尋找新的治療靶點，保護胰島β細胞，以預防糖尿病的發(fā)生。

參考文獻：

[1]Geurts L,Muccioli GG,Delzenne NM,et al.Chronic endocannabinoid system stimulation induces muscle macrophage and lipid accumulation in type 2 diabetic mice independently of metabolic endotoxaemia[J].PLoS One,2013,8(2):e55963.

[2]Jones SA,Mills KH,Harris J.Autophagy and inflammatory diseases[J].Immunol Cell Biol,2013, 91(3):250-258.

[3]Gottlieb RA,Mentzer RM Jr.Autophagy:an affair of the heart[J].Heart FailvRev,2013,18(5): 575-584.

[4]Dutta D,Xu J,Kim JS,et al.Upregulated autophagy protects cardiomyocytes from oxidative stress-induced toxicity[J].Autophagy,2013,9(3):328-344.

[5]Lin SY1,Li TY,Liu Q,et al.GSK3-TIP60-ULK1 signaling pathway links growth factor deprivation to autophagy[J].Science,2012,336(6080):477-481.

[6]Mizushima N,Levine B,Cuervo AM,et al.Autophagy fights disease through cellular self digestion[J].Nature,2008,451(7182):1069-1075.

[7]Mizushima N.Autophagy:process and function[J].Genes Dev,2007,21(22):2861-2873.

[8]Bodemann BO,Orvedahl A,Cheng T,et al.RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly[J].Cell,2011,144(2):253-267.

[9]Proikas-Cezanne T,Takacs Z,Dnnes P,et al.WIPI proteins: essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome[J].J Cell Sci,2015,128(2):207-217.

[10] Nakarai H,Yamashita A,Nagayasu S,et al.Adipocyte-macrophage interaction may mediate LPS-induced low-grade inflammation:potential link with metabolic complications[J].Innate Immun,2012,18(1):164-170.

[11] Kaliannan K,Hamarneh SR,Economopoulos KP,et al.Intestinal alkaline phosphatase prevents metabolic syndrome in mice[J].Proc Natl Acad Sci,2013,110(17):7003-7008.

[12] Blasco-Baque V,Serino M,Vergnes JN,et al.High-fat diet induces periodontitis in mice through lipopolysaccharides (LPS) receptor signaling: protective action of estrogens[J].PLos One,2012,7(11):e48220-e48220.

[13] Gao J, Zhan Y, Chen J, et al. Triptolide ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J].Eur J Med Res,2013,18(1):1-7.

[14] Hagiwara S,Iwasaka H,Hidaka S,et al.Danaparoid sodium inhibits systemic inflammation and prevents endotoxin-induced acute lung injury in rats[J].Crit Care,2008,12(2):321-321.

[15] Dai L,Datta G,Zhang Z,et al.The apolipoprotein A-I mimetic peptide 4F prevents defects in vascular function in endotoxemic rats[J].J Lipid Res,2010,51(9):2695-2705.

[16] Yang Y,Cheng Y,Lian QQ,et al.Contribution of CFTR to alveolar fluid clearance by lipoxin A4 via PI3K/Akt pathway in LPS-induced acute lung injury[J].Mediators Inflamm,2013,2013(6): 862628

[17] Chen Z,Jalabi W,Shpargel KB,et al.Lipopolysaccharide-induced microglial activation and neuroprotection against experimental brain injury is independent of hematogenous TLR4[J].J Neurosci,2012,32(34):11706-11715.

[18] Bian Y,Zhao X,Li M,et al.Various roles of astrocytes during recovery from repeated exposure to different doses of lipopolysaccharide[J].Behav Brain Res,2013,253(18):253-261.

[19] Qin L,Wu X,Block ML,et al.Systemic LPS causes chronic neuroinflammation and progressive neurodegeneration[J].Glia,2007,55(5):453-462.

[20] Franois A,Terro F,Quellard N,et al.Impairment of autophagy in the central nervous system during lipopolysaccharide-induced inflammatory stress in mice[J].Mol Brain,2014,7(56):10.1186.

[21] Kitazawa M,Oddo S,Yamasaki TR,et al.Lipopolysaccharide-induced inflammation exacerbates tau pathology by a cyclin-dependent kinase 5-mediated pathway in a transgenic model of Alzheimer′s disease[J].J Neurosci,2005,25(39):8843-8853.

[22] Wu Y,Zhang Y,Wang L,et al.The role of autophagy in kidney inflammatory injury via the NF-κB route induced by LPS[J].Int J Med Sci,2015,12(8):655-667.

[23] 劉斯靈,郝亞榮.脂多糖誘導的自噬在心血管方面的研究進展[J].心血管病學進展,2011,32(6):834-836.

[24] Scharl M,Rogler G.Inflammatory bowel disease:dysfunction of autophagy[J].Dig Dis,2012, 30(Suppl3):12-19.

[25] Hampe J,Franke A,Rosenstiel P,et al.A genome-wide association scan of nonsynonymous SNPs identifies a susceptibility variant for Crohn disease in ATG16L1[J].Nat Genet,2007,39(2): 207-211.

[26] 婁金麗,張慧蕓,陳德喜.急性肝損傷小鼠肝組織中的自噬現(xiàn)象[J].北京醫(yī)學,2013,35(6):443-445.

[27] 龔清安,李瑩,司小萌.丙泊酚預先給藥對急性肺損傷大鼠自噬相關蛋白Beclin-1表達的影響[J].中華實驗外科雜志,2014,31(12):2770-2771.

[28] Chen S,Yuan J,Yao S,et al.Lipopolysaccharides may aggravate apoptosis through accumulation of autophagosomes in alveolar macrophages of human silicosis[J].Autophagy,2015,11(12):2346-2357.

[29] Saitoh T,Fujita N,Jang MH,et al.Loss of the autophagy protein Atg16L1 enhances endotoxin-induced IL-1beta production[J].Nature,2008,456(7219):264-268.

[30] Harris J,Hartman M,Roche C,et al.Autophagy controls IL-1β secretion by targeting pro-IL-1β for degradation[J].J Biol Chem,2011,286(11):9587-9597.

[31] Duran A,Amanchy R,Linares JF,et al.p62 is a key regulator of nutrient sensing in the mTORC1 pathway[J].Mol Cell,2011,44(1):134-146.

[32] Deretic V,Jiang S,Dupont N.Autophagy intersections with conventional and unconventional secretion in tissue development, remodeling and inflammation[J].Trends Cell Biol,2012,22(8): 397-406.

[33] Dupont N,Jiang S,Pilli M,et al.Autophagy-based unconventional secretory pathway for extracellular delivery of IL-1β[J].EMBO J,2011,30(23):4701-4711.

[34] Ehses JA,Perren A,Eppler E,et al.Increased number of islet-associated macrophages in type 2 diabetes[J].Diabetes,2007,56(9):2356-2370.

[35] Richardson SJ,Willcox A,Bone AJ,et al.Islet-associated macrophages in type 2 diabetes[J]. Diabetologia,2009,52(8):1686-1688.

[36] Marselli L,Bugliani M,Suleiman M,et al.β-Cell inflammation in human type 2 diabetes and the role of autophagy[J].Diabetes Obes Metab,2013,15(Suppl3):130-136.

[37] Rowe PA,Campbell-Thompson ML,SchatzDA,et al.The pancreas in human type 1 diabetes[J].Semin Immunopathol,2011,33(1):29-43.

[38] Jung HS,Chung KW,Kim JW,et al.Loss of autophagy diminishes pancreatic β cell mass and function with resultant hyperglycemia[J].Cell Metab,2008,8(4):318-324.

[39] Quan W,Hur KY,Lim Y,et al.Autophagy deficiency in beta cells leads to compromised unfolded protein response and progression from obesity to diabetes in mice[J].Diabetologia,2012, 55(2):392-403.

[40] DeFronzo RA.Dysfunctional fat cells,lipotoxicity and type 2 diabetes[J].Int J Clin Pract, 2004,58(Suppl 143):9-21.

[41] Banerjee M,Saxena M.Interleukin-1 (IL-1) family of cytokines:role in type 2 diabetes[J].Clin Chim Acta,2012,413(15):1163-1170.

[42] Moscat J,Diaz-Meco MT.p62 at the crossroads of autophagy, apoptosis,and cancer[J].Cell, 2009,137(6):1001-1004.

作者單位：1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南洛陽471003

The Role of Autophagy in Inflammation Induced by LPS and the Apoptosis of Beta Cell of Pancreatic Islet

WANG Lin-Lei, JIANG Hong-Wei, MA Yu-jin, WANG Jie, FAN Meng-lin, HUANG Ke

(1.First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.College of Clinical Medicine of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the research progress of autophagy in inflammatory disease and explore the affection of autophagy on islet beta cells.MethodsRetrieving published literatures at home and abroad, we reviewed autophagy and its possible mechanism in acute or chronic inflammatory models induced by lipopolysaccharide (LPS),and discussed autophagy of beta cells in the pancreatic islet inflammation.ResultsLPS could induce systemic inflammation response with the change of autophagy. Autophagy plays a crucial role in beta cell quantity, structure and function. Deficient autophagy β-cells would be an important factor in the transition from islet inflammation to diabetes.ConclusionAutophagy plays an important role in the pathophysiology of pancreatic beta cell apoptosis and maintaining the balance of inflammation. Autophagy imbalance can lead to a variety of diseases. Regulation of autophagy through drugs may be a novel therapy for inflammatory disease and diabetes.

Key words:autophagy；lipopolysaccharide；inflammation；diabetes mellitus beta cell；apoptosis

文章編號：1672-688X(2016)02-0152-05

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.026

中圖分類號：R364.5，R587.1;R329.2+8

文獻標志碼：A

基金項目：國家自然科學基金項目(編號：U1404805)

收稿日期：2016-03-08

作者簡介：王霖蕾(1989-)，女，河南獲嘉人，從事內分泌及代謝疾病臨床工作。

通信作者：姜宏衛(wèi)，男，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：29202777@qq.com