崔垚，安宇，金桐宇，張帆，何品剛

（華東師范大學化學與分子工程學院，上海 200241）

表面納米溝槽對成纖維細胞定向行為的影響

崔垚，安宇，金桐宇，張帆*，何品剛*

（華東師范大學化學與分子工程學院，上海 200241）

在皮膚傷口愈合中，細胞的定向行為對加速傷口愈合起著非常重要的作用。該文采用納米壓印技術制備了線寬為200 nm、周期為400 nm及深度為200 nm的溝槽結構，用于模擬體內的細胞外基質。將成纖維細胞L929培養(yǎng)在納米溝槽上，觀察細胞的延長和鋪展方向，對細胞的定向行為進行了定量分析。結果表明，L929細胞在納米溝槽上具有良好的延長性，并能夠沿著納米溝槽的方向鋪展，說明制備的納米溝槽能夠誘導成纖維細胞的定向行為，為皮膚傷口快速愈合的臨床研究奠定了基礎。

納米溝槽；成纖維細胞；定向行為

0 引言

皮膚是生命體重要的保護屏障，能夠阻擋病原體的侵入、維持體內溫度以及防止體液流失，一旦受到傷害，必須及時愈合。在皮膚傷口愈合的過程中，細胞外基質起著非常重要的作用，它包含了大量的納米纖維類結構成分[1]，這些納米結構可以誘導細胞的行為，包括繁殖、遷移等[2]。真皮成纖維細胞是傷口愈合中的主要功能細胞之一[3]，當皮膚受到創(chuàng)傷時，成纖維細胞會向傷口定向遷移，使傷口收縮，促進愈合[4]。如果它的行為出現(xiàn)異常，就會造成傷口愈合延緩并留下異常疤痕。因此，誘導受傷組織有效、快速地進行修復，同時減少疤痕形成是非常重要的。

近年來，研究者發(fā)現(xiàn)微納米尺度形貌對細胞行為能夠產(chǎn)生很大的影響，其中納米溝槽是非常重要的類型之一，它由于更加接近人體的真實環(huán)境而備受關注[5-6]。納米溝槽對細胞有很強的“接觸引導”作用[6]，可使細胞在特定的方向上鋪展、排列、生長、遷移等[7-10]。細胞的定向行為對組織的修復和再生有很大的促進作用，因此，已應用于研究皮膚傷口愈合、骨頭再生、干細胞分化等生物過程[8,11-12]。納米溝槽的尺寸對于細胞定向行為具有很大的影響[13]，為了能夠有效誘導皮膚成纖維細胞的定向行為，該文利用納米壓印技術制備了納米尺度的溝槽結構，并定量分析了成纖維細胞L929在納米溝槽上的定向行為，對皮膚創(chuàng)傷快速修復的臨床研究起到了一定的推動作用，以期推動再生醫(yī)學和整形科學的發(fā)展。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素混合液（P/S）和0.25%胰蛋白酶（含EDTA）均購自Gibco公司。臺盼藍溶液、PBS片劑、戊二醛、丙酮和乙醇均購自Sigma公司。成纖維細胞L929購自上海博谷生物科技有限公司。

倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯IX51）購買自奧林巴斯（中國）有限公司。NU-5500E二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱和NU-425-400E生物安全柜購買自NuAire（美國）公司。CRYOSYSTEM 750液氮儲藏罐購自于MVE（美國）公司。SX-500高壓滅菌鍋，購置于TOMY（日本）公司。恒溫水槽CU-600購自于上海一恒科學儀器有限公司。離心機L-600購自于湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 納米溝槽的制備

石英具有良好的生物相容性和透光性，因此用作加工納米溝槽的基底。首先，在干凈、干燥的石英片上涂覆層光刻膠，之后將納米壓印模板壓在上面，并施以一定的壓力，待光刻膠固化后，移去模板，接著通過反應離子刻蝕技術，在石英基底上得到納米溝槽結構，最后，將殘留的光刻膠去除（圖1）。

圖1 納米溝槽制備過程示意圖Fig.1Schematic illustration of the nano-grooves fabrication process

1.3 細胞培養(yǎng)

L929細胞培養(yǎng)于由DMEM培養(yǎng)基（89%）、FBS（10%）和P/S（1%）配制而成的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。待細胞匯合度達到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、離心、臺盼藍染色計數(shù)后，以2000細胞/cm2接種于納米溝槽上進行培養(yǎng)。

接種細胞之前，納米溝槽在丙酮和乙醇溶液中分別浸泡30 min，超聲清除表面殘留的有機物，接著在蒸餾水中超聲清洗15 min，之后，高溫（120℃）滅菌20 min，紫外照射1 h。

1.4 細胞定向行為的觀察和分析

細胞培養(yǎng)24 h后，選取納米溝槽上多處不同部位進行顯微鏡拍照，用于觀察細胞的定向行為（以平面石英基底作為對照），同時以細胞之間不能接觸且每張照片中細胞數(shù)目大于40為原則，選取10張圖片進行細胞定向行為的定量分析。

為了進一步觀察細胞在納米溝槽上的定向行為，該文利用掃描電子顯微鏡（SEM）對細胞進行了表征，表征之前，對細胞進行了固定和脫水，步驟如下：細胞培養(yǎng)24 h后，棄去原有培養(yǎng)液并加入1 mL PBS溶液清洗3次，之后加入2.5%～3.0%戊二醛固定2.5 h，接著依次加入30%、50%、75%、80%、95%和100%（2次）乙醇進行梯度脫水（15 min/次，）干燥后進行SEM拍照。

2 結果與討論

2.1 納米線的表征

從SEM和原子力顯微鏡（AFM）圖片中可以看到制備的納米溝槽方向一致，排列規(guī)則，圖形完整，線寬和周期分別為200 nm和400 nm，深度為200 nm左右（圖2）。

2.2 細胞在納米溝槽上的定向行為

圖2 納米溝槽的SEM圖(A)和AFM圖(B)Fig.2SEM image(A)and AFM image(B)of nano-grooves

將L929細胞培養(yǎng)在納米溝槽上，24 h后，從圖3中可以看到大多數(shù)細胞是沿著納米溝槽方向鋪展和排列的，且有一定程度的延長，而在平面上，細胞是無序的，向著各個方向延伸和鋪展。細胞的SEM圖進一步清楚地顯示細胞骨架與納米溝槽方向相一致，細胞呈現(xiàn)出良好的定向性（圖4）。

2.3 細胞定向行為的定量分析

為了定量分析L929細胞在納米溝槽上的定向行為，該文對細胞的延長度和鋪展方向進行了統(tǒng)計。首先通過Photoshop軟件提取出細胞輪廓，然后由Image J軟件擬合成橢圓（圖5）。將橢圓的長軸和短軸分別定義為細胞的長和寬，它們之間的比值定義為細胞的延長度（E）[14-15]。如果E大于4，則認為細胞是延長的。同時，將細胞長軸和納米溝槽方向之間的夾角定義為θ，如果θ小于10°，則認為細胞能夠沿著納米溝槽的方向定向鋪展。

圖3 L929細胞在納米溝槽(A)和平面基底(B)上的顯微鏡圖片(箭頭表示納米溝槽方向)Fig.3Microscopic observations of L929 cells on nano-grooves(A)and flat surface(B)(The direction of nano-grooves is indicated by the arrow)

圖4 L929細胞在納米溝槽上的SEM圖Fig.4SEM image of L929 cells on nano-grooves

圖5 細胞擬合及參數(shù)示意圖Fig.5Schematic representation of cell fitting and parameters

從細胞延長度的分布情況可以看到（圖6A），71.22%細胞的E值大于4，5.96%細胞的E值在3到4之間，說明延長的細胞所占比例是較高的。圖6B是細胞與納米溝槽之間角度的分布情況，顯示56.33%細胞的θ小于10度，23.57%細胞的θ在10度到20度之間，表明大部分細胞與納米溝槽之間的夾角是比較小的，也就是說細胞是沿著納米溝槽的方向鋪展的，表現(xiàn)出良好的定向行為。

圖6 L929細胞在納米溝槽上E值(A)和θ值(B)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)Fig.6Statistical data of E value(A)and alignment angle θ(B)for L929 cells on nano-grooves

3 結論

該文以石英為基底，制備了線寬200 nm、周期400 nm及深度200 nm的溝槽結構，將L929細胞培養(yǎng)在納米溝槽上，結果表明成纖維細胞L929能夠沿著納米溝槽方向鋪展和排列，并有一定的延長，說明細胞在納米溝槽上產(chǎn)生了良好的定向行為。該文的研究將在一定程度上促進臨床皮膚傷口快速愈合研究的發(fā)展，對再生醫(yī)學和整形科學具有重要的意義。

[1]Martin P.Wound healing-Aiming for perfect skin regeneration[J].Science,1997,276:75-81.

[2]Yildirimer Lara,Thanh Nguyen T K,Seifalian Alexander M.Skin regeneration scaffolds:a multimodal bottom-up approach[J].Trends Biotechnol.,2012,30:638-648.

[3]Ehrlich H Paul,Krummel Thomas M.Regulation of wound healing from a connective tissue perspective[J]. Wound Repair Regen.,1996,4:203-210.

[4]Gurtner Geoffrey C,Werner Sabine,Barrandon Yann,etal.Wound repair and regeneration[J].Nature,2008, 453:314-321.

[5]von der Mark Klaus,Park Jung,Bauer Sebastian,et al. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces:cues from the extracellular matrix[J].Cell Tissue Res.,2010,339: 131-153.

[6]Flemming R G,Murphy C J,Abrams G A,et al.Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior[J].Biomaterials,1999,20:573-588.

[7]Zhang Qing,Dong Hua,Li Yuli,et al.Microgrooved polymer substrates promote collective cell migration to accelerate fracture healing in an in vitro model[J].ACS Appl. Mater.Inter.,2015,7:23336-23345.

[8]Hong Nam Kim,Yoonmi Hong,Min Sung Kim,et al.Effect of orientation and density of nanotopography in dermal wound healing[J].Biomaterials,2012,33:8782-8792.

[9]Gerecht Sharon,Bettinger Christopher J,Zhang Zhitong, et al.The effect of actin disrupting agents on contact guidance of human embryonic stem cells[J].Biomaterials,2007,28:4068-4077.

[10]Deok-Ho Kim,Lipke E A,Pilnam Kim,et al.Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs[J].PNAS,2010,107:565-570.

[11]Subramony Siddarth D,Dargis Booth R,Castillo Mario,et al.The guidance of stem cell differentiation by substrate alignment and mechanical stimulation[J].Biomaterials, 2013,34:1942-1953.

[12]Raucci Maria G,Guarino Vincenzo,Ambrosio Luigi. Biomimetic strategies for bone repair and regeneration [J].J.Funct.Biomater.,2012,3:688-705.

[13]Loesberg W A,te Riet J,van Delft F C M J M,et al.The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion[J].Biomaterials,2007,28:3944-3951.

[14]Nealey P F,Murphy C J,Teixeira A I,et al.The effect of environmental factors on the response of human corneal epithelial cells to nanoscale substrate topography[J]. Biomaterials,2006,27:3945-3954.

[15]Yim Evelyn K F,Pang Stella W,Leong Kam W.Synthetic nanostructures inducing differentiation of human mesenchymal stem cells into neuronal lineage[J].Exp.Cell Res.,2007,313:1820-1829.

Effect of nano-grooves on the alignment of fibroblasts

Cui Yao,An Yu,Jin Tong-yu,Zhang Fan*,He Pin-gang*
(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China Normal University,Shanghai 200241,China)

The alignment behavior of cells plays a very important role in accelerating skin wound healing.In this paper,nano-imprinting technique was used to fabricate a nano-grooves structure with 200 nm in width of grooves, 400 nm in period and 200 nm in depth,simulating the extracellular matrix in vivo.L929 cells were cultured on the nano-grooves,followed by the observation and quantitative analysis of cell elongation and spreading direction.The results showed that L929 cells could be elongated and spread along the direction of nano-grooves,thus it could be concluded that the prepared nano-grooves could induce the alignment behavior of fibroblasts,which would lay the foundation for the rapid healing of skin wounds in clinical research.

nano-grooves;fibroblasts;cell alignment

國家自然科學基金資助項目（21405049）

*通信聯(lián)系人,E-mail:fzhang@chem.ecnu.edu.cn;pghe@chem.ecnu.edu.cn