謝靚，付艷，金晶，李群芳

(湖北民族學院化學與環(huán)境工程學院，湖北恩施 445000)

電化學法對珍菊降壓片中蘆丁的測定

謝靚，付艷，金晶，李群芳*

(湖北民族學院化學與環(huán)境工程學院，湖北恩施 445000)

目的：建立電化學法對珍菊降壓片中蘆丁的含量測定方法。方法：將堿法恒電位法活化的玻碳電極置于氯金酸溶液中在-0.2V條件下恒電位沉積一層納米金，發(fā)現(xiàn)電極對蘆丁有良好的電化學響應。結(jié)果：在最優(yōu)條件下對蘆丁標準溶液進行測定，當蘆丁濃度在0.02～12 μmol/L與DPV峰電流呈良好的線性關(guān)系，檢測限為0.007 μmol/L(S/N=3)。結(jié)論：該方法準確、可靠，可用于珍菊降壓片中蘆丁含量的測定。

珍菊降壓片；蘆??；電化學法；含量測定

0 引言

珍菊降壓片是常用的降壓藥，其為中西藥結(jié)合的一種制劑，成分有三味中藥和兩味西藥組成,包含有：野菊花膏粉、珍珠層粉、蘆丁、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪等成分，該藥用于臨床各種高血壓的治療，具有療效好，起效快，無副作用等特點，是目前高血壓防治的主要措施之一[1]。其質(zhì)量標準已收載于部頒中藥20冊，僅有珍珠層粉和蘆丁的定性鑒別，沒有任何含量測定項，不能準確、全面地控制產(chǎn)品質(zhì)量。珍菊降壓片中蘆丁的含量為20 mg/片，主要作用是改變?nèi)梭w內(nèi)毛細血管的通透性和張力，其與另外四味藥共同作用達到降壓的作用，是不可缺少的一味主藥。對珍菊降壓片中主要成分蘆丁的含量進行測定，可更好地控制該藥物的產(chǎn)品質(zhì)量，完善其質(zhì)量標準。蘆丁含量測定大多采用高效液相色譜法[2-3]，而該文采用電化學法對制劑中蘆丁的含量進行測定，經(jīng)方法學考察，表明該方法簡捷快速，準確可靠，有很好的選擇性，可作為控制珍菊降壓片質(zhì)量的含量測定方法。

1 儀器與試藥

JSM-7800F掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）；CHI660E電化學工作站(上海CHI公司)；三電極體系：工作電極為玻碳電極，參比電極為Hg/Hg2Cl2(飽和KCl)，并以鉑絲電極作為對電極。HAuCl4·4H2O（w=99.9%）購于Alfa Aesar（美國）。蘆丁對照品，批號100080-200306，由中國藥品生物制品檢定所提供，無水乙醇為溶劑配制濃度為1×10-3mol/L的蘆丁儲備液，置于4℃冰箱保存。不同pH的B-R緩沖溶液用均為0.04 mol/L的磷酸、硼酸、乙酸和0.2 mol/L氫氧化鈉溶液混合配置而成。珍菊降壓片，亞寶藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)（產(chǎn)品批號：141229）。其他試劑均為分析純試劑，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 電化學測試方法

實驗中采用CV法測試和示差脈沖伏安法（DPV）測試均在常規(guī)電解池中進行。每次測試前溶液均通氮除氧10 min，測試過程中在溶液上方通氮保護，所有實驗均在室溫條件下進行。CV法測量的參數(shù)設(shè)置：掃描電位區(qū)間0.2～0.8 V，掃描速率0.1 V/s。DPV法測量的參數(shù)設(shè)置：掃描電位區(qū)間0.2～0.7 V，電位增量0.004 V，振幅50 mV，脈沖寬度50 ms，脈沖幅度1 s。工作電極表面重復方法：每次測試后取出電極，先在0.1 mol/L NaOH溶液中以0.1 V/s的速率在0～0.8 V的范圍內(nèi)循環(huán)掃描3圈，然后在B-R緩沖溶液中以0.1 V/s的速率在0～0.8 V的范圍內(nèi)循環(huán)掃描至穩(wěn)定

2.2 電極的制備與SEM表征

將玻碳電極（GCE）依次用0.3、0.1、0.05 μm的Al2O3打磨光亮，然后分別用二次蒸餾水、丙酮、乙醇超聲清洗干凈后室溫下晾干。參照文獻[4]，以堿法恒電位法活化玻碳電極（activiate GCE，AGCE）：將電極置于1 mol/L NaOH溶液中分別在1.2 V、-0.5 V恒電位條件下極化1 min，然后采用循環(huán)伏安法在-0.5～0.8 V以0.1 V/s的掃速至電化學響應曲線穩(wěn)定。再將活化的電極用二次蒸餾水沖洗，晾干，置于HAuCl4（1%）溶液中在-0.2 V的條件下恒電位沉積60 s得到納米金顆粒修飾的活化玻碳電極（記為：AuNPs/AGCE）。AuNPs/AGCE電極采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察了表面形貌，結(jié)果如圖1所示。在活化后玻碳電極表面可以清晰地看到顆粒狀的納米金顆粒，大小均一，粒徑約為20 nm，均勻地覆蓋在電極表面，說明納米金修飾的玻碳電極形成。高導電性的納米金顆粒能有效增加電極的比表面積，而且還能形成一個良好的電化學界面[5]。

圖1 AuNPs/AGCE的掃描電鏡圖Fig.1SEM image of AuNPs/AGCE

2.3 蘆丁在不同電極下的CV響應

在pH2.68的B-R緩沖溶液中，研究1×10-5mol/L蘆丁在不同修飾電極下的CV響應曲線，結(jié)果如圖2所示。在裸玻碳電極（a）表現(xiàn)出一對明顯的氧化還原峰，這是蘆丁在玻碳電極上發(fā)生氧化還原反應形成。電極經(jīng)堿法恒電位法活化（b）使得峰電流增大，而當AuNPs/AGCE（c）形成以后，峰電流進一步增加，且氧化峰電流和還原峰電流絕對值之比為1.40，兩峰之間的電位差縮小變?yōu)?5 mV，說明蘆丁在AuNPs/AGCE電極上的電化學行為表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移電子數(shù)為2的準可逆的氧化還原反應，可推測氧化還原峰電流是由蘆丁B環(huán)上的3’、4’位置的羥基反應所產(chǎn)生，這與文獻報導的結(jié)果一致[4]。持續(xù)增大的電流響應說明金納米顆粒和活化的玻碳電極共同作用能顯著催化蘆丁發(fā)生電化學反應。

圖2 l×10-5mol/L蘆丁在不同電極下的CV響應(a) GCE(b)AGCE(c)AuNPs/AGCEFig.2Cyclic voltammograms responses of different modified electrodes in l×10-5mol/L rutin(a)GCE(b)AGCE (c)AuNPs/AGCE

2.4 掃速對蘆丁檢測的影響

從圖3可發(fā)現(xiàn)隨著掃描速率（0.02～0.1 V/s）的增加，氧化峰、還原峰的峰電流不斷增加，且掃速呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為I μA= -(31.92±1.45)v(V/s)-(0.15±0.09)，r2=0.9918；IμA= (31.66±1.82)v(V/s)–(0.0306±0.11)，r2=0.9869說明蘆丁在電極表面受吸附控制。將在蘆丁標準液中進行過CV掃描后的電極取出，用二次蒸餾水沖洗表面之后直接置于空白B-R緩沖液中再次掃描，出現(xiàn)了氧化峰和還原峰，但峰電流變小，進一步說明電極對蘆丁存在吸附作用。

圖3 蘆丁在不同掃描速率下的CV響應Fig.3Cyclic voltammograms responses of rutin under different scan rates

2.5 pH對DPV測量的影響

用AuNPs/AGCE電極對l×10-5mol/L蘆丁在不同pH的B-R緩沖溶液中進行示差脈沖伏安法（DPV）測試。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，在B-R緩沖溶液中，蘆丁氧化峰電化學響應良好，隨著pH值的不斷增加，電化學信號漸弱，且峰電位負移，且峰電位與pH值的大小呈線性關(guān)系，Epa=-(0.0637± 0.0019)pH+(0.6689±0.0102)，r2=0.9962。該方程的斜率與能斯特方程的等質(zhì)子電子傳遞理論值斜率59接近，則表明蘆丁在氧化反應中是等質(zhì)子等電子參與的反應，最終選擇峰電流最強的pH= 2.86的B-R緩沖溶液作為支持電解質(zhì)。

2.6 對蘆丁標準溶液進行測定

AuNPs/AGCE電極在最優(yōu)化的條件下，用DPV法對不同濃度的蘆丁標準溶液進行電化學檢測，結(jié)果如圖5所示。隨著蘆丁標準溶液的濃度不斷增大，DPV氧化峰峰電流響應不斷增強，且濃度在0.02～12 μmol/L時與峰電流值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為IμA=-(0.5065±0.0197) c μmol/L-(2.0204±0.1270)(r2=0.9925)，檢測限為0.007 μmol/L（S/N=3）。與高效液相色譜法相比，該法對蘆丁的含量測定具有線性范圍更寬，檢測限更低的優(yōu)點。

2.7 電極的選擇性、穩(wěn)定性、重復性和精密度

在實驗體系中加入200 μmol/L L-半胱氨酸、200 μmol/L葡萄糖作為干擾物，考察其對蘆丁氧化峰電流響應的影響。實驗結(jié)果表明：這些成分對峰電流的影響相對標準偏差不超過5%，珍菊降壓片中其他組分如鹽酸可樂定、氫氯噻嗪電極在此條件下無電化學響應，AuNPs/AGCE對蘆丁有很好的選擇性，珍菊降壓片中其他組分無干擾。

圖41 ×10-5mol/L蘆丁在不同pH下的DPV響應Fig.4DPV response of 1×10-5mol/L rutin with different pH

圖5 蘆丁標準溶液的檢測，(A)不同濃度蘆丁標準溶液在電極上的DPV響應；(B)蘆丁濃度與峰電流之間的線性關(guān)系圖Fig.5(A)DPV curves of the electrochemical sensor toward rutin standards(B)DPV curves corresponding to linear plots

實驗分別制備6支AuNPs/AGCE電極在相同條件下對1×10-5mol/L蘆丁進行測定，測定結(jié)果RSD=3.94%，說明電極制備方法重復性良好。選取其中一支電極對同一濃度的蘆丁溶液進行測定，平行測定6次的結(jié)果RSD=2.95%，證明該電極應用于對蘆丁測定具有良好的精密度。測試后將電極于4℃條件下保存在B-R空白溶液中，分別在7 d和15 d后再次測定，RSD均不超過5%，證明電極穩(wěn)定性較好。

2.8 對珍菊降壓片中蘆丁的測定

取珍菊降壓片20片，精密稱定，將藥片研磨成細粉，精密稱取細粉適量（約相當于蘆丁5 mg）置100 mL的容量瓶中，加入20 mL無水乙醇超聲30 min后，抽濾后用無水乙醇將提取液于容量瓶中定容至100 mL，成待測樣品溶液。取適量待測樣品稀釋，進行紫外測試，樣品特征吸收帶與蘆丁標準品溶液基本一致，證明待測樣品中的黃酮類化合物主要成分為蘆丁。取1 mL續(xù)濾液于25 mL的容量瓶中用B-R緩沖溶液定容至刻度。此時樣品溶液理論的蘆丁濃度為4.19 μmol/L，將制備好的電極對樣品溶液進行平行測定，得到結(jié)果的平均值為4.14±0.05 μmol/L，結(jié)果表明該降壓片中蘆丁測定含量與標明含量較吻合，測定結(jié)果與標示值較符合。證明AuNPs/AGCE可以用于對珍菊降壓片制備過程中蘆丁含量的檢測。

2.9 加樣回收實驗

已測定含量的樣品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量，精密加入蘆丁對照溶液適量，按含量測定項下處理成一定濃度的溶液，照該法測定。測定結(jié)果見表1，結(jié)果表明：蘆丁9次測定回收率在95.2%～105.3%之間。

表1 珍菊降壓片中蘆丁的測定結(jié)果Tab.1Measurement results of rutin in Zhenjujiangya Tablet(n=3)

3 結(jié)論

實驗基于AuNPs/AGCE電極構(gòu)建了一種簡單靈敏的測定蘆丁含量的電化學分析法。電極制備簡單，對蘆丁的檢測具有良好的穩(wěn)定性、精密度和選擇性，得到一個寬的線性范圍和低的檢測限，可用于對珍菊降壓片中蘆丁含量的測定。

[1]吳躍進,黃湘.中西藥復方降壓藥珍菊降壓片的研究與應用概況[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2005,11(3): 238-241.

[2]姜慧禎,林娜.珍菊降壓片中蘆丁的含量測定[J].甘肅醫(yī)藥,2010,29(5):575-577.

[3]耿旦,馬雯芳,甄漢深,等.RP-HPLC測定桑椹中蘆丁的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(14):63-65.

[4]胡海洋,陳紅艷.電化學法對苦蕎茶中蘆丁含量的測定[J].食品科學,2015,36(8):115-119.

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Determination of rutin in the zhenjujiangya tablet by electrochemical method

Xie Jing,Fu Yan,Jin Jing,Li Qun-fang*
(School of Chemical and Environmental Engineering,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China)

Objective:To establish a method for determination of rutin in Zhenjujiangya tablet by electrochemical method.Methods:Glassy carbon electrode activated by potentiostatic alkaline method was immersed into gold chloride acid solution to electro-deposite Au nanoparticles under-0.2 V,and the electrode has a good elctrochemical response signal to rutin.Results:under optimal conditions,when the concentration of rutin standard solution from 0.02～12 μmol/L,DPV peak current had good linear relationship between concentration,and the detection limit was 0.007 μmol/L(S/N=3).Conclusion:The method is rapid,accurate and suitable for the determination rutin in the compound Tablet.

zhenjujiangya tablet;rutin;electrochemical method;assay

湖北民族學院博士啟動基金（MY2014B014）

*通信聯(lián)系人,E-mail:slindar809@126.com