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        羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀對抗大鼠缺血再灌注心肌炎癥反應(yīng)和凋亡

        2016-04-05 06:59:15史曉靜王高頻陶貴周
        中成藥 2016年1期
        關(guān)鍵詞:再灌注損傷心肌缺血炎癥反應(yīng)

        史曉靜, 趙 琳, 王高頻, 陶貴周

        (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,遼寧錦州121001)

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        羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀對抗大鼠缺血再灌注心肌炎癥反應(yīng)和凋亡

        史曉靜, 趙 琳, 王高頻, 陶貴周

        (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,遼寧錦州121001)

        摘要:目的 觀察羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷(MIRI)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白介素-1(inter 1eukin-1,IL-1)、心肌細(xì)胞內(nèi)Caspases-3和NF-κB表達的影響,探討其心肌保護作用機制。方法 將40只雄性SD大鼠隨機等分為4組,假手術(shù)組(生理鹽水5 mL/d)、缺血再灌注組(生理鹽水5 mL/d)、阿托伐他汀預(yù)處理組[阿托伐他汀20 mg/(kg.d)]和羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組[羥基紅花黃色素A 10 mg/(kg.d)+阿托伐他汀20 mg/(kg.d)]。灌胃7 d后,第8天制作大鼠在體心肌I/R模型,結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min,再灌注120 min后,各組術(shù)后分別應(yīng)用心臟超聲檢測心功能指標(biāo),HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化,用ELISA法檢測心肌中TNF-a和IL-1β濃度,Western b1ot檢測活化Caspase-3和NF-κB的表達。結(jié)果 與缺血再灌注組比較,阿托伐他汀預(yù)處理組心功能指標(biāo)、組織病理改變明顯改善(P<0.05),羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組改善更顯著;與缺血再灌注組比較,阿托伐他汀預(yù)處理組TNF-a和IL-1β濃度明顯減少(P<0.05),Caspases-3和NF-κB表達明顯減少(P<0.05);與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組TNF-a、IL-1β、Caspases-3及NF-κB表達減少更為明顯(P<0.05)。結(jié)論 羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理明顯抑制炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,減輕MIRI損傷,呈現(xiàn)加強的心肌保護作用,其機制可能與抑制心肌NF-KB表達有關(guān)。

        關(guān)鍵詞:心肌缺血-再灌注損傷(MIRI);羥基紅花黃色素A;阿托伐他?。谎装Y反應(yīng);凋亡

        心肌缺血再灌注損傷(myocardia1ischemia reperfusion injury,MIRI)在臨床上十分常見,病理生理過程復(fù)雜,其發(fā)生機制可能與多種因素有關(guān),細(xì)胞凋亡可能是MIRI發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)[1]。研究發(fā)現(xiàn),羥基紅花黃色素A和阿托伐他汀具有明顯的心血管保護作用,但二者合用是否可有相互增強作用及機制目前尚不明確。本研究建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,觀察羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響,并探討可能的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑 羥基紅花黃色素A(山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心,純度≥98%);阿托伐他?。⑵胀祝x瑞制藥有限公司,20 mg×7片/盒);兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體,購自美國Ce11Signa1ing Techno1ogy公司;兔抗NF-κB多克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechno1ogy公司;二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔1gG抗體,購自美國Santa Cruz公司;內(nèi)參照物購自武漢博士德公司。

        1.2 動物及分組 健康成年雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量200~250 g,由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供,動物合格證號SYXK(遼)2013-0005號。隨機分為假手術(shù)組(生理鹽水5 mL/d)、缺血-再灌注組(生理鹽水5 mL/d)、阿托伐他汀預(yù)處理組[(阿托伐他汀20 mg/(kg.d)]和羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組[羥基紅花黃色素A 10 mg/(kg.d)]和阿托伐他?。?0 mg/(kg.d)],每組10只。灌胃7 d后,第8天制作大鼠在體心肌I/R模型。

        1.3 模型制備 參照相關(guān)文獻,采用阻斷大鼠冠狀動脈左前降支建立缺血再灌注損傷動物模型。將大鼠乙醚麻醉下仰位固定于手術(shù)臺,自左側(cè)3~4肋間開胸,暴露心臟,于肺動脈圓錐及左心房間找出冠狀動脈左前降支,假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎,其余各組均以0號線快速結(jié)扎左冠脈,缺血30 min后再次開胸,剪斷絲線使血流再通,復(fù)灌120 min后處死動物,取出心臟。所有大鼠術(shù)前禁食、禁飲,麻醉后氣管插管,接動物呼吸機控制呼吸;接好生理記錄儀;開放尾靜脈輸液;全程記錄和分析心電圖、心率(HR)的變化。

        1.4 給藥方法 各組動物均于模型制作前7 d灌胃給藥,每日1次,連續(xù)7次,A組和B組灌胃生理鹽水5 mL/kg,C組和D組分別灌胃阿托伐他汀[20 mg/(kg.d)(溶于生理鹽水中)],D組腹腔注射羥基紅花黃色素A 10 mg/(kg.d)。

        1.5 檢測指標(biāo) 再灌注120 min后,各組術(shù)后分別應(yīng)用心臟超聲檢測心功能指標(biāo),HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化,每組大鼠應(yīng)用ELISA法檢測心肌中TNF-a和IL-1β濃度。試劑均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒,操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。Western b1ot方法檢測活化Caspase-3和NF-κB的表達。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 心功能指標(biāo) 各組術(shù)后心率差異不顯著(P>0.05)。與假手術(shù)組相比,缺血-再灌注組左心室收縮壓(1eft ventricu1ar systo1ic pressure,LVSP)及左心室射血分?jǐn)?shù)(1eft ventricu1ar ejection fraction,LVEF)顯著降低,左心室舒張末壓(1eft ventricu1ar end diasto1ic pressure,LVEDP)顯著增高(P<0.05);與缺血-再灌注組比較,阿托伐他汀預(yù)處理組LVSP及LVEF顯著增高,LVEDP顯著降低(P均<0.05),羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組改善更明顯。見表1。

        表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

        表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

        注:與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與缺血-再灌注組比較,*P<0.05;與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,**P<0.05

        組別 LVSP/mmHg LVEDP/mmHg  心率次/min LVEF/%假手術(shù)組150.2±3.2 1.7±0.2 342±10 82.56±3.80缺血-再灌注組 96.1±3.8# 11.2±2.0# 344±11 63.40±3.05#阿托伐他汀組 122.3±4.1* 4.8±1.6* 340±9 72.68±3.55*聯(lián)合組 146.8±4.4** 2.3±0.8** 341±7 79.86±4.15**

        2.2 心肌組織病理學(xué)改變 鏡下觀察發(fā)現(xiàn),正常組心肌細(xì)胞排列整齊,肌纖維橫紋清晰,未見變性或壞死以及炎細(xì)胞浸潤。模型組細(xì)胞排列紊亂,明顯腫脹,肌纖維部分?jǐn)嗔?,橫紋模糊或消失,片狀壞死區(qū)細(xì)胞核碎裂或崩解,炎性浸潤明顯。阿托伐他汀預(yù)處理組心肌細(xì)胞排列較整齊,部分細(xì)胞水腫變性,肌纖維間隙水腫,偶見炎性細(xì)胞浸潤。羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組組心肌細(xì)胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好,壞死和炎性癥象有所減輕,有效地對抗心肌細(xì)胞損傷。

        2.3 炎癥因子變化 與假手術(shù)組比較,缺血-再灌注組大鼠TNF-a和IL-1β濃度明顯增加(P<0.05);與缺血-再灌注組比較,阿托伐他汀預(yù)處理組TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度明顯減少(P<0.05);與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組減少TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度更為明顯(P<0.05)。見表2。

        表2 各組大鼠心肌TNF-a和IL-1β濃度變化(±s)

        表2 各組大鼠心肌TNF-a和IL-1β濃度變化(±s)

        注:與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與缺血-再灌注組比較,*P<0.05;與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,▲P<0.05

        組別  動物數(shù)  劑量 TNF-a/(ng.mL-1)IL-1β/(ng.mL-1)假手術(shù)組10 - 5.70±1.54 1.33±0.13缺血-再灌注組 10 - 52.24±7.97# 12.96±1.28#阿托伐他汀組 10 20 mg/(kg.d) 25.42±4.18* 6.10±0.94*聯(lián)合組 10  羥基紅花黃色素A 10 mg/(kg.d)+阿托伐他汀20 mg/(kg.d) 17.07±3.86▲ 3.16±0.41▲

        2.4 Caspase-3蛋白表達 與假手術(shù)組比較,缺血-再灌注組Caspase-3蛋白表達明顯增加(P<0.05);與缺血-再灌注組比較,阿托伐他汀預(yù)處理組Caspase-3蛋白表達明顯減少(P<0.05);與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組Caspase-3蛋白表達減少更為明顯(P<O.05)。見表3。

        表3 各組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達的變化(±s)

        表3 各組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達的變化(±s)

        注:與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與缺血-再灌注組比較,*P<0.05;與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,▲P<0.05

        Caspase-3假手術(shù)組組別  動物數(shù)  劑量1.08±0.06缺血-再灌注組 10 - 5.96±0.39#阿托伐他汀組 10 20 mg/(kg.d) 3.28±0.19*聯(lián)合組 10  羥基紅花黃色素A 10 mg/(kg.d)+阿托伐他汀20 mg/(kg.d)  2.06±0.16 10 -▲

        2.5 NF-κB表達 與假手術(shù)組比較,缺血-再灌注組NF-κB表達明顯增加(P<0.05);與缺血-再灌注組比較,阿托伐他汀預(yù)處理組NF-κB表達明顯減少(P<0.05);與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理組NF-κB表達減少更為明顯(P<0.05)。見表4。

        表4 各組大鼠心肌組織NF-κB表達的變化(±s)

        表4 各組大鼠心肌組織NF-κB表達的變化(±s)

        注:與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與缺血-再灌注組比較,*P<0.05;與阿托伐他汀預(yù)處理組比較,▲P<0.05

        組別  動物數(shù)  劑量NF-κB假手術(shù)組3.08±0.20缺血-再灌注組 10 - 10.86±0.61#阿托伐他汀組 10 20 mg/(kg.d) 6.02±0.59*聯(lián)合組 10  羥基紅花黃色素A 10 mg/(kg.d)+阿托伐他汀20 mg/(kg.d) 4.06±0.38 10 -▲

        3 討論

        研究顯示,心肌缺血再灌注損傷與炎癥因子產(chǎn)生、內(nèi)皮損傷、細(xì)胞凋亡及核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等機制有關(guān)。心肌缺血階段炎癥反應(yīng)即被激活,再灌注則明顯加劇了心肌的炎癥反應(yīng)。此病理生理過程激活機體炎癥細(xì)胞釋放大量促炎因子:如白介素-1(inter 1eukin-1,IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)及干擾素等并且調(diào)節(jié)特異性免疫細(xì)胞反應(yīng),引起比原打擊更大損傷的炎癥反應(yīng)。而心肌缺血再灌注損傷便是炎癥反應(yīng)過度表達,系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)共同參與的結(jié)果[2-6]。

        細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷后細(xì)胞死亡的主要方式。Caspase-3是啟動凋亡程序的關(guān)鍵蛋白酶。Cspase-3表達的增加、激活是外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑2種凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中共同的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶[7]。本研究表明,缺血再灌注組Caspase-3表達比假手術(shù)組明顯增加,提示缺血再灌注過程中出現(xiàn)了大量的細(xì)胞凋亡。

        NF-κB是一種廣泛存在于多種不同細(xì)胞,具有調(diào)控細(xì)胞因子、化學(xué)因子及立早蛋白等功能的轉(zhuǎn)錄因子,是一個對氧化還原狀態(tài)敏感的轉(zhuǎn)錄因子,對炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞生存和增生都具有調(diào)節(jié)作用,是一個參與炎癥反應(yīng)新的作用靶點[8-9]。NF-κB的異常激活與心肌細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系[10-11]。在本研究中,缺血再灌注組NF-κB表達明顯增加,提示其參與了缺血再灌注損傷的病理過程。

        紅花是非常重要的中草藥,內(nèi)含紅色素和黃色素2種色素。紅花黃色素是從紅花花瓣中提取的天然色素,屬于查耳酮類化合物,具有擴張冠狀動脈血管、抗氧化、保護心肌、降血壓、免疫抑制等多種藥理功能。羥基紅花黃色素A為紅花主要水溶性有效成分。阿托伐他汀具有抗炎、抗栓、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善內(nèi)皮功能、抑制血管平滑肌增殖等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀可能通過多種途徑及機制發(fā)揮抗氧化、抗凋亡等多種心肌保護作用[12]。本研究顯示I/R后大鼠收縮及舒張功能均受損,組織損傷嚴(yán)重,采用阿托伐他汀治療后LVSP、LVEDP、LVEF及組織結(jié)構(gòu)有所改善,聯(lián)合組改善效果更明顯。本實驗也證實阿托伐他汀組TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度明顯減少;聯(lián)合組TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度(P<0.05)減少更為明顯。表明二者聯(lián)合能更有效降低心肌TNF-a和IL-1β質(zhì)量濃度,減輕炎癥反應(yīng),減輕再灌注損傷。此外阿托伐他汀組Caspase-3表達明顯減少;聯(lián)合組Caspase-3表達減少更為明顯。表明二者聯(lián)合能更有效抑制心肌細(xì)胞凋亡。在本研究中還顯示,阿托伐他汀預(yù)處理能明顯減少NF-κB表達(P<0.05),聯(lián)合組減少NF-κB表達效果更加明顯。提示二者聯(lián)合可能通過抑制NF-κB表達從而對抗炎癥反應(yīng),降低心肌細(xì)胞凋亡,減輕再灌注損傷。

        總之,細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷中重要的病理生理機制,羥基紅花黃色素A聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理能減輕心肌炎癥反應(yīng),減少心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能,二者聯(lián)合表現(xiàn)出更加明顯的心肌保護作用,其機制可能與抑制NF-κB表達有關(guān)。

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        作者簡介:史曉靜(1973—),女,博士生,研究方向為冠心病和心律失常。Te1:13941622062,E-mai1:shixiaojing3000@163.com

        收稿日期:2014-09-18

        doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.039

        中圖分類號:R966

        文獻標(biāo)志碼:B

        文章編號:1001-1528(2016)01-0170-03

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