730030 蘭州大學第二醫(yī)院泌尿外科研究所，甘肅省泌尿系疾病研究重點實驗室，甘肅省泌尿系統疾病臨床醫(yī)學中心

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·綜述與講座·

LncRNA與腎癌關系的研究進展

田躍軍綜述洪梅陶燕郭琦王志平審校

730030 蘭州大學第二醫(yī)院泌尿外科研究所，甘肅省泌尿系疾病研究重點實驗室，甘肅省泌尿系統疾病臨床醫(yī)學中心

關鍵詞：腎細胞癌；lncRNA；藥物靶點

lncRNA是一組內源性，長度大于200個核苷酸單位，缺少特異性開放閱讀框，幾乎不具備蛋白編碼功能的RNA分子，也稱為長鏈非編碼RNA。lncRNA可在轉錄水平、轉錄后水平、表觀遺傳學水平等方面參與基因的表達調控，從而影響機體的生長、發(fā)育、衰老、死亡等生命過程。近年來研究發(fā)現lncRNA有著類似癌基因或抑癌基因的作用，并與腎癌細胞的增殖、侵襲、轉移及預后密切相關。本文將對lncRNA在腎癌中的研究進展進行論述，并探討lncRNA與腎癌發(fā)生、發(fā)展之間的關系，為尋找腎癌分子標志物、藥物靶點提供新的方向。

1LncRNA的特性和作用機制

lncRNA是一類轉錄本長度在200 nt~100 kb之間的非編碼RNA分子，多數由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成，其亞細胞定位多樣化，在細胞核、細胞質和細胞器中均有分布。lncRNA多數情況下較長，具有mRNA樣結構，有些具有poly(A)尾巴，而有些沒有poly(A)尾巴，在分化過程中有動態(tài)的表達和不同的剪接方式，其與編碼基因相比，lncRNA的表達量更低。不同組織之間的lncRNA表達量不相同，既具有組織特異性；同時lncRNA也具有時空特異性，即同一組織或器官在不同生長階段，其中的lncRNA表達量也可以發(fā)生變化[1]。lncRNA不僅在腫瘤的發(fā)病機制，而且在心血管、自身免疫、感染性及神經性疾病等方面都有重要作用[2]。目前研究[3]證實lncRNA具有以下功能：①招募染色質重塑復合物到特定的基因組位點并使其發(fā)生催化活性。②結合轉錄因子在編碼蛋白基因的上游啟動子區(qū)域轉錄，進而干擾鄰近蛋白編碼基因的表達。③抑制RNA聚合酶Ⅱ，與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切，進而產生不同的剪切形式；或在Dicer酶作用下產生內源性的siRNA，調控基因的表達水平。④結合在特定的蛋白質上調節(jié)相應蛋白的活性或改變蛋白的胞質定位。⑤作為小分子RNA的前體分子轉錄，如微小RNA(microRNAs，miRNAs)、piRNA。所以lncRNA異常表達可以促使腫瘤在內的多種疾病的發(fā)生。

2LncRNA與腎癌

腎癌又稱腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，是一種來源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤。腎癌約占成人惡性腫瘤的3%，其發(fā)病率逐年升高[4]。手術切除是惟一有效的治愈方法，但是20%~30%的患者術后會出現轉移或復發(fā)。而且腎癌對放化療、免疫治療等不敏感，所以一直是困擾臨床醫(yī)生的難題[5-6]。同時腎癌本身是多基因相關性腫瘤?，F代分子生物學的發(fā)展揭示基因突變、缺失、重復和染色體重排等在腎癌的發(fā)生中起著重要的作用[7]。例如有文獻報道[8]Zeste基因增強子同源物2(EZH2)通過上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達從而促進腎透明細胞癌的發(fā)生、發(fā)展。近年來的研究證實，在真核生物轉錄組中存在的大量lncRNA，它們參與了X染色體沉默、基因印記以及染色體修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等調控過程，這也為我們對腎癌的研究提供了一個新的方向[9]。

2.1MALAT-1

MALAT-1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1)即肺腺癌轉移相關轉錄本1，主要位于人染色體11q13.1，長約8.7 kb，最早在非小細胞肺癌中被報道[10]。研究同時還發(fā)現在腎癌中MALAT-1與轉錄因子TFFB形成融合體，TFFB作為轉錄因子調控多個重要通路，兩者融合后可以保護TFFB的整個編碼序列，顯著增加TFFB蛋白表達水平，促進腫瘤的進展[11]。Zhang等[12]用PCR分析發(fā)現腎透明細胞癌組織和癌細胞株786-O和ACHN中MALAT-1的表達水平明顯高于癌旁組織和正常腎細胞株HK-2，伴隨著MALAT-1在腎透明癌中的表達水平越高，患者有一個更加不良的預后。此外，Hirashi等[13]發(fā)現沉默MALAT-1的表達時，E-cadherin被激活，同時β-catenin的表達通過EZH2被降低，他們認為MALAT-1過表達促進了腎癌上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，進而促進腎癌細胞的轉移。同時他們還發(fā)現了MALAT-1和miR-205之間的關系，即MALAT-1對miR-205有一種負性調控作用，MALAT-1通過下游效應分子EZH2特異性通道，使miR-205沉默，促使腎癌細胞的增殖和侵襲能力增強，因此他們認為MALAT-1在腎癌中可能是一種促癌因子。

2.2SPRY4-IT1

SPRY4-IT1 (Gen Bank accession ID AK024556) 位于人染色體5p31.3，長約708 nt，是一種典型的內含子lncRNA，在黑色素瘤中表達較高，SPRY4-IT1的二級結構含有多個莖環(huán)和假結，而目前研究顯示lncRNA的特殊二級結構可與蛋白分子結合發(fā)揮生物學功能，從而促進腫瘤的形成[14]。Peng等[15]研究發(fā)現SPRY4-IT1的表達水平在胃癌組織和細胞中明顯高于正常人胃組織和細胞，而且隨著SPRY4-IT1表達水平的增高，患者預后更差，當沉默SPRY4-IT1的表達水平后，胃癌細胞的侵襲和轉移能力減弱。他們進一步發(fā)現在胃癌細胞株和組織中，SPRY4-IT1主要通過激活cyclin D1、MMP2、 MMP9的表達，促進胃癌細胞的增殖。他們認為SPRY4-IT1在胃癌中起到一個促癌基因的作用。Zhang等[16]用PCR檢測4對標本中SPRY4-IT1的表達情況，結果顯示SPRY4-IT1在腎癌組織中的表達量顯著高于正常癌旁組織。用siRNA干擾SPRY4-IT1表達后，分別采用wound healing法、流式細胞儀和Transwell法檢測其對細胞增殖、凋亡和遷移的影響，發(fā)現腎癌細胞株遷移能力與對照組相比明顯降低，但細胞增殖無明顯變化，細胞凋亡變化亦不明顯。他們認為SPRY4-IT1在腎細胞癌組織中高表達，并且能促進腎癌細胞遷移，可能成為判斷腎癌預后的重要分子標志物。

2.3HOTAIR

HOTAIR全長約2158 nt，位于染色體12q13.13的HOXC11與HOXC12基因之間，共含6個外顯子，包括5個短外顯子及1個長外顯子[17]。研究證實PRC2(poly-comb repressive complex 2)和LSD1(lysine specific demethylase 1)與HOTAIR結合的結構域具有廣泛不同的二級結構，HOTAIR存在2個獨立的結合位點(分別結合PRC2及LSD1)，在PRC2及LSD1之間起著“橋梁”作用。HOTAIR通過特異性雙向結合的能力結合PRC2與LSD1位點，引起復雜的生物學級聯效應[18]。Pei等[19]通過PCR發(fā)現HOTAIR在多種腎癌細胞株中高表達，在姜黃色素的介導作用下，表達HOTAIR的腎癌細胞株的轉移能力顯著高于不表達HOTAIR的腎癌細胞株，他們認為HOTAIR可能是在姜黃色素誘導的作用下促進了腎癌細胞的轉移。Chiyomaru等[20]研究證實在腎癌細胞中，HOTAIR同樣表現為高表達，而miR-141低表達，當降低免疫復合物Ago2時，miR-141表達上調，HOTAIR的表達沉默，他們miR-141對HOTAIR有一種負性調控作用時，這也為我們研究miRNA與lncRNA之間的關系提供了一個新的證據。Wu等[21]研究發(fā)現當沉默HOTAIR表達時，腎癌細胞的生長周期被阻滯在G0/G1期，癌細胞的增殖和侵襲能力明顯受到抑制，同時HOTAIR與基因EZH2和組蛋白H3K27三甲基化(H3K27me3)結合能力減弱。而既往研究[22]認為EZH2和H3K27me3在腎癌中扮演著抑癌基因作用，其高表達預示腎癌患者更差的預后。Wu等認為HOTAIR與基因EZH2和H3K27me3之間存在著正相關，同時HOTAIR在腎癌中發(fā)揮著抑癌基因作用。

2.4MEG3

母系表達基因3(materally expressed gene3，MEG3)定位于人類染色體14q32.3，長度約為1.6 kb，隸屬于人類母源性印記基因DLK1-MEG3單元，主要通過轉錄產物長鏈非編碼RNA MEG3發(fā)揮抑癌作用。MEG3在多種正常細胞中表達，尤其在腦組織中高表達。MEG3能通過促進p53蛋白表達來抑制腫瘤細胞的增殖，同時通過調節(jié)VEGH和Notch信號傳導途徑抑制血管生成，進而參與細胞增殖、分化、凋亡等生命活動[23]。受表觀遺傳控制，其啟動子CpG島，尤其位于該基因功能區(qū)重要序列的5' 側翼1和4區(qū)域的高甲基化，可以導致包括p53在內的多種轉錄因子的永久性失活，從而失去抗增殖能力，導致腫瘤的發(fā)生。Kawakami等[24]研究發(fā)現DLK1在腎癌中可作為抑癌基因存在。DLK1在正常腎組織較為常見，但多數原發(fā)性腎細胞癌(RCCs)及RCC來源的癌細胞株出現DLK1的表達缺失，同時發(fā)現MEG3上游的甲基化導致RCCs來源的DLK1失活。若將DLK1重新導入裸鼠體內，發(fā)現裸鼠體內腫瘤細胞的生長受到抑制。Kawakami等[24]在研究中也發(fā)現，在腎細胞癌中，MEG3表達缺失與其被甲基化有關，MEG3區(qū)域高甲基化是導致腎癌發(fā)生的主要因素，所以他們證實MEG3在腎癌的形成中起著抑制作用，是一種抑癌基因。

2.5H19

H19基因位于人染色體11p15.5，全長2.3 kb，共有5個外顯子及4個內含子，主要存在于細胞質內，高度表達于胚胎發(fā)育期，主要集中表達于內胚層及中胚層來源的組織，與胰島素樣生長因子2 (IGF2)是一對交互印記基因。H19是第一個被發(fā)現的腫瘤相關lncRNA，具有致癌和抑癌的雙重作用[25]。H19和IGF2基因通常一起受差異甲基化區(qū)域(differentially methylated region，DMR)調控，H19調控區(qū)DMR有絕緣子蛋白(CCCTC-binding factor，CTCF)的結合位點，CTCF能和母本染色體上非甲基化的DNA結合，從而阻斷H19下游的增強子和母本IGF2等位基因的相互作用[26]。Ludgate等研究通過[27]腎母細胞瘤(Wilms瘤)患者與正常腎細胞比較發(fā)現，Wilms瘤患者中印記基因IGF2/H19調控區(qū)DMR異常甲基化，其H19表達明顯缺失。Charlton等[28]檢測了13個腎母細胞瘤患者，發(fā)現其中的11個患者的H19基因位點調控區(qū)DMR發(fā)生顯著甲基化，正常腎組織(normal kidneys，NKs)低于腎源性殘余(nephrogenic rests，NRs)的甲基化水平，NRs甲基化水平低于Wilms瘤的甲基化水平。而且隨著Wilms瘤的惡性程度增加，腎癌細胞的甲基化水平越高，即H19的表達水平越低。他們認為H19是腎母細胞瘤的一個抑癌基因。

2.6GAS5

生長停滯特異性轉錄本5(growth arrest-specific 5，GAS5)是通過差減雜交技術從大鼠NIH3T3細胞克隆得到的，位于人類染色體1q25.1，通過選擇性剪切可產生多種異構體[29]。Pickard等[30]發(fā)現GAS5表達的缺失在前列腺癌在內的多種惡性腫瘤中發(fā)生，在前列腺癌中當降低GAS5的表達水平時，可以顯著抑制前列腺癌細胞的增殖和轉移能力。Liu等[31]研究發(fā)現GAS5在膀胱癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，當降低GAS5的表達量時，膀胱癌細胞的侵襲能力顯著增強。他們進一步證明GAS5在一定程度上通過調控細胞周期蛋白(cyclin-dependent protein kinase 6，CDK6)的表達來抑制膀胱癌的增殖。Qiao等[32]通過挑選12個腎透明細胞癌的臨床樣品，發(fā)現腎癌組織中GAS5的表達水平顯著低于正常腎組織，而且腎癌細胞株A498中的GAS5表達量低于正常腎細胞系HK-2。此外，他們進一步實驗發(fā)現在腎癌細胞株A498細胞中，GAS5過表達抑制腎透明細胞癌增殖，誘導細胞凋亡并阻滯細胞周期，與對照組相比腎癌細胞株A498的轉移和侵襲能力被明顯抑制。因此，他們認為GAS5可能是腎癌的一個抑癌基因。

綜上所述，隨著高通量檢測技術的成熟和應用以及生物信息學的迅猛發(fā)展，lncRNA具有的表達調控功能相繼被發(fā)現，不僅豐富了基因組的復雜性，而且使我們認識到一些lncRNA在腎癌中的異常表達情況，使得我們對lncRNA與腎癌的聯系研究更加深入[33]。但是腎癌中l(wèi)ncRNA的生物學認識過程依然緩慢，其功能和機制尚有諸多不明確，而且與腎癌聯系密切的lncRNA為數不多，未來仍需進一步探討其與影響腎癌發(fā)生發(fā)展的作用機制?，F有研究發(fā)現在腎癌中異常表達lncRNA的機制以及l(fā)ncRNA異常表達對腎癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移、侵襲所產生影響的機制，為我們下一步治療腎癌打下了基礎，能否有效的控制lncRNA在腎癌中適當的表達量是我們下一步需要克服的難題。相信隨著研究深入，lncRNA在腎癌的分子靶向治療和藥物研發(fā)等方面必將揭開一個新的篇章。

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(編輯：甘艷)

(收稿日期2015-06-22修回日期 2015-09-28)

文章編號：1001-5930(2016)04-0685-03

中圖分類號：R737.11

文獻標識碼：B

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.053

通信作者：王志平

基金項目：國家自然科學基金(編號：81302240)；甘肅省科技計劃(編號：145RJZA153)；蘭州大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費(編號：lzujbky-2013-134、lzujbky-2014-165)；甘肅省泌尿系疾病臨床醫(yī)學中心開放課題(編號：mnlczxkf-23)