肖 偉 綜述，劉躍建，龍懷聰 審校

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.呼吸科，b.老年科，四川 成都 610072)

誘導(dǎo)痰技術(shù)及在支氣管哮喘中的應(yīng)用

肖 偉1綜述，劉躍建2a，龍懷聰2b審校

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.呼吸科，b.老年科，四川 成都 610072)

近10年來(lái)，誘導(dǎo)痰技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中得到了日益廣泛的應(yīng)用，也為呼吸系統(tǒng)疾病提供了一種簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、安全的檢查方法。本文綜述了誘導(dǎo)痰技術(shù)的方法、誘導(dǎo)痰細(xì)胞及液相成份在哮喘研究及臨床中的應(yīng)用。

誘導(dǎo)痰；哮喘；生物標(biāo)志物；臨床應(yīng)用

誘導(dǎo)痰技術(shù)始于1958年，最初是用于診斷肺癌，后來(lái)逐漸應(yīng)用于肺結(jié)核、卡氏肺孢子蟲(chóng)肺炎等呼吸道感染性疾病的診斷。1992年P(guān)in等為研究支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)第一次通過(guò)改良的方法獲得誘導(dǎo)痰。近年來(lái)大家對(duì)這種通過(guò)非侵入性手段獲得呼吸道疾病生物標(biāo)記物的方法，表現(xiàn)出越來(lái)越濃厚的興趣。誘導(dǎo)痰的細(xì)胞成分(如嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)、蛋白質(zhì)成分(例如粘蛋白和細(xì)胞因子)和微生物組分(如病毒和細(xì)菌)可以被用作疾病的嚴(yán)重性、急性發(fā)作、臨床進(jìn)展以及治療效果評(píng)價(jià)的標(biāo)志物[1，2]。近年來(lái)，誘導(dǎo)痰技術(shù)作為呼吸道疾病(如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)檢查的一種手段，正因其無(wú)創(chuàng)性、安全性及可重復(fù)性越來(lái)越受到大家重視。以下就對(duì)誘導(dǎo)痰技術(shù)及其在哮喘中的應(yīng)用做一綜述，以便大家對(duì)其有更加深入的了解。

1 誘導(dǎo)痰的方法

1.1 誘導(dǎo)痰的收集 誘導(dǎo)痰技術(shù)是以高滲鹽水霧化吸入誘導(dǎo)無(wú)痰或少痰患者產(chǎn)生足量痰液，以便對(duì)下氣道分泌物中的細(xì)胞及其他液相成分進(jìn)行分析研究的一種無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法。目前常用的誘導(dǎo)方法有兩種：①在固定的時(shí)間段霧化吸入相同濃度或漸增濃度的高滲鹽水。②吸入高滲鹽水(4.5%)的濃度不變，逐漸增長(zhǎng)吸入時(shí)間。誘導(dǎo)方法的選擇對(duì)痰細(xì)胞成分與計(jì)數(shù)幾乎不影響，但痰誘導(dǎo)的持續(xù)時(shí)間必須保持一致，因?yàn)樗赡軙?huì)影響痰中的細(xì)胞成分及計(jì)數(shù)。早期的痰樣品中含有更多的粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。誘導(dǎo)痰的時(shí)間一般控制在10～20分鐘為宜。

不論使用哪種誘導(dǎo)技術(shù)，均不是絕對(duì)安全的。高滲鹽水可引起哮喘患者氣道的嚴(yán)重收縮，誘發(fā)哮喘發(fā)作。因此在操作開(kāi)始前讓患者吸入短效β2受體激動(dòng)劑，以降低患者對(duì)痰誘導(dǎo)的不耐受及危險(xiǎn)性。目前已經(jīng)證實(shí)，同一哮喘患者行或不行沙丁胺醇預(yù)處理，對(duì)誘導(dǎo)痰的細(xì)胞成分及計(jì)數(shù)均無(wú)影響[3]。此外，哮喘患者使用支氣管擴(kuò)張劑后一秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)<65%預(yù)測(cè)值，建議使用等滲鹽水代替高滲鹽水。使用高滲或等滲鹽水不改變誘導(dǎo)痰的細(xì)胞或生化讀數(shù)[4]。對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，歐洲呼吸學(xué)會(huì)Task Force小組推薦的步驟可作為操作的指導(dǎo)。

1.2 痰液的處理 獲得痰標(biāo)本后，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理，以減少細(xì)胞成分及細(xì)胞計(jì)數(shù)的偏差。然而，放置在冰箱中的樣品，在4 ℃下保存，待測(cè)時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，不會(huì)影響細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，但存放時(shí)間不宜超過(guò)24小時(shí)[5]。目前有兩種痰處理方法。第一種方法，選擇痰液中黏稠部分。第二種方法是不經(jīng)選擇，將整個(gè)痰液及唾液進(jìn)行處理。將樣品放入預(yù)稱(chēng)重的聚苯乙烯管中并稱(chēng)重。不經(jīng)選擇的樣本加入等體積的二硫蘇糖醇(DTT)或經(jīng)選擇的樣本加入4倍體積DTT。這是兩種方法的不同之處，后續(xù)步驟完全一致。DTT打破了粘蛋白分子的二硫鍵，使細(xì)胞分散。用吸管反復(fù)吹打樣品，然后在渦流混合器中攪拌30秒鐘，在37 ℃振蕩水浴中振蕩10～30分鐘。通過(guò)48微米尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾除粘液和碎屑。過(guò)濾后懸液以2000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5分鐘，以便細(xì)胞從上清液中分離。上清液可儲(chǔ)存在-70 ℃冰箱中，以備后用。將1%小牛血清PBS緩沖液加入離心沉渣中，使其體積等于離心前。用臺(tái)盼蘭排染法測(cè)定細(xì)胞活力，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。剩余的細(xì)胞混懸液加入細(xì)胞涂片離心機(jī)中制片并以姬姆薩染色。至少計(jì)數(shù)400非鱗狀上皮細(xì)胞，并報(bào)告為巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，表示為總的非鱗狀細(xì)胞的百分比。鱗狀細(xì)胞的百分比應(yīng)單獨(dú)報(bào)告。對(duì)兩種取痰方法的對(duì)比發(fā)現(xiàn)選取法優(yōu)于全選法[6]。

2 誘導(dǎo)痰是研究哮喘的一種重要工具

2.1 誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué) 健康受試者誘導(dǎo)痰細(xì)胞成分以巨噬細(xì)胞[非吸煙組(62.74±12.85)%，吸煙組(57.73±14.37)%]和中性粒細(xì)胞[非吸煙組(29.53±18.87)%，吸煙組(39.94±18.52)%]為主，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞數(shù)量較少[7]。哮喘患者和健康受試者相比誘導(dǎo)痰的細(xì)胞成分有明顯不同。與健康受試者相比，哮喘患者痰中所含的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量更多。非類(lèi)固醇治療的哮喘患者痰嗜酸性粒細(xì)胞比例為0～75%，近一半哮喘患者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞>5%，約17%的哮喘患者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例超過(guò)20%。相反，在未治療的輕度到中度哮喘患者中有31%的患者痰液中嗜酸性粒細(xì)胞未見(jiàn)顯著升高(>2%)[8]。這個(gè)結(jié)果與肺活檢及支氣管肺泡灌洗的結(jié)果相一致。嗜酸性粒細(xì)胞的聚集與激活直接引起氣道炎癥，在哮喘的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。雖然痰中嗜酸性粒細(xì)胞增多是哮喘的典型特征，但并非所有哮喘患者的誘導(dǎo)痰均相似的細(xì)胞分布。在有25%未治療的成人哮喘及50%糖皮質(zhì)激素治療的成人哮喘患者誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在正常范圍[9]。在這些非嗜酸性哮喘患者中有一部分患者痰中中性粒細(xì)胞明顯升高，特別是哮喘急性發(fā)作者。因此，根據(jù)誘導(dǎo)痰細(xì)胞相對(duì)數(shù)的不同，哮喘可被分為四種表型：嗜酸性哮喘(嗜酸性粒細(xì)胞比例>2%)，嗜中性粒細(xì)胞性哮喘(嗜中性粒細(xì)胞比例>61%)，混合粒細(xì)胞性哮喘(中性粒細(xì)胞比例>60%和嗜酸性粒細(xì)胞比例>2%)和粒細(xì)胞缺乏性哮喘(各種細(xì)胞相對(duì)數(shù)均在正常范圍內(nèi))[10]。

與粒細(xì)胞不同，淋巴細(xì)胞的比例相對(duì)較少約為1%～2%，很少超過(guò)5%。雖然痰中淋巴細(xì)胞比例較低，但通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)痰細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的分析表明，哮喘患者CD4+T淋巴細(xì)胞和表達(dá)CD54受體(ICAM-1)的T淋巴細(xì)胞的比例增加，而NK細(xì)胞比率降低[11]。該研究結(jié)果與哮喘的氣道炎癥由活化的CD4+T細(xì)胞調(diào)控的概念相一致。哮喘的發(fā)生主要是因其機(jī)體免疫耐受功能受損，而活化的CD4+T細(xì)胞在機(jī)體免疫耐受中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

2.2 流體相的生化標(biāo)志物 誘導(dǎo)痰上清液可測(cè)定多種生化標(biāo)志物。嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)和類(lèi)胰蛋白酶，作為嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化標(biāo)志物，均能在哮喘患者誘導(dǎo)痰上清液中提取出，且明顯高于健康者，這進(jìn)一步證實(shí)嗜酸性粒細(xì)胞增多是哮喘的特征之一[12]。嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)也可以作為哮喘嚴(yán)重程度的一個(gè)臨床指標(biāo)，且ECP比嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與肺功能更具有相關(guān)性[13]。哮喘的另一個(gè)基本特征是氣道重構(gòu)?？扇苄灾貥?gòu)相關(guān)蛋白，如膠原蛋白的合成肽、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)和細(xì)胞因子，也可在痰上清液檢測(cè)[14]。誘導(dǎo)痰中還可以檢測(cè)到多種生長(zhǎng)因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是其中一種，該VEGF及其受體的表達(dá)與氣道炎癥及氣道重構(gòu)具有密切關(guān)系。增高的VEGF表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞表型哮喘、氣流受限及哮喘的嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)，從而為預(yù)防和治療嚴(yán)重哮喘提供幫助[15]。

3 誘導(dǎo)痰技術(shù)在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用及前景

繼非特異性支氣管高反應(yīng)性的測(cè)定后，痰嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)成為診斷哮喘最有效的檢查方法。通過(guò)測(cè)定痰中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量可對(duì)哮喘患者吸入糖皮質(zhì)激素的療效進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究顯示：嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘對(duì)激素的治療反應(yīng)性明顯高于中性粒細(xì)胞性哮喘[16]。痰嗜酸性粒細(xì)胞增多與吸入激素后臨床癥狀改善程度正相關(guān)。研究表明：基于痰嗜酸粒細(xì)胞的哮喘的治療能有效地減少哮喘惡化及復(fù)發(fā)[2]；然而，基于FeNO水平的哮喘治療，在改善兒童和成人哮喘結(jié)果中，并未被證明有效[17]。這可能對(duì)臨床醫(yī)師在不久的將來(lái)治療哮喘的策略產(chǎn)生影響，因?yàn)檫@將意味著部分哮喘患者將不能從吸入糖皮質(zhì)激素治療中獲益。

此外，痰嗜酸性粒細(xì)胞也可作為預(yù)測(cè)哮喘復(fù)發(fā)的一個(gè)指標(biāo)，Giannini等的研究顯示痰嗜酸性粒細(xì)胞比例對(duì)哮喘癥狀復(fù)發(fā)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為71%，而陰性預(yù)測(cè)值為84%[18]。痰嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)可以作為氣道炎癥極好的生物標(biāo)志物，也可以作為疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)記物。此外痰嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(%)也可用于預(yù)測(cè)哮喘的控制狀態(tài)[19，20]。并且，痰嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)值比另一個(gè)哮喘氣道炎癥的非侵入性標(biāo)記物NO水平更有意義。

4 總結(jié)與展望

近年來(lái)誘導(dǎo)痰分析已成為研究呼吸系統(tǒng)疾病氣道炎癥評(píng)估的非侵入性的方法。因誘導(dǎo)痰技術(shù)的安全性、無(wú)創(chuàng)性、良好的耐受性為該技術(shù)的推廣奠定了基礎(chǔ)。目前，該方法已得到標(biāo)準(zhǔn)化，從而明顯提高痰標(biāo)本的質(zhì)量及可重復(fù)性。但由于誘導(dǎo)痰技術(shù)的操作時(shí)間及費(fèi)用問(wèn)題，限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。更重要的是，雖然誘導(dǎo)痰細(xì)胞分析的短期重復(fù)性似乎是不錯(cuò)的[21]，但炎性表型不穩(wěn)定，并且可以自發(fā)或隨治療的改變而變化，單一的誘導(dǎo)痰檢查不能可靠地預(yù)測(cè)持續(xù)性氣道炎癥表型[22]。

盡管如此，誘導(dǎo)痰技術(shù)仍然值得推廣。它不僅可以在氣道炎癥性疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病及慢性咳嗽等的診斷、病情評(píng)估、疾病監(jiān)測(cè)以及治療選擇中起到重要作用，亦可為肺結(jié)核、呼吸系統(tǒng)腫瘤的診斷提供一種安全且耐受性良好的檢查手段，為疾病的診斷提供依據(jù)[23～24]。

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Induced sputum technique and its application in asthma

XIAO wei1，LIU Yue-jian2a，LONG Huai-chong2b

四川省科技廳科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2012JY0056)

R562.2+5

B

1672-6170(2016)03-0159-03

2015-12-08；

2016-01-24)