曾風(fēng)華綜述，王小中審校

（1、吉安市青原區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，江西吉安343009；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006）

同型半胱氨酸的檢測方法及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

曾風(fēng)華1綜述，王小中2審校

（1、吉安市青原區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，江西吉安343009；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006）

同型半胱氨酸是半胱氨酸代謝的中間產(chǎn)物，其代謝異常所導(dǎo)致的高同型半胱氨酸血癥己被證實與冠狀動脈粥樣硬化、中風(fēng)、高血壓、冠心病等心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、肥胖、慢性腎病以及缺鐵性貧血相關(guān)。本文將簡要介紹有關(guān)同型半胱氨酸和半胱氨酸的一些新的檢測方法和同型半胱氨酸在某些疾病治療中的研究進(jìn)展。

同型半胱氨酸；檢測方法；心腦血管疾??；神經(jīng)退行性疾病

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種α-氨基酸，通過一些酶及輔助因子（B6，B12或葉酸）的作用，能夠轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸或半胱氨酸（cysteine，Cys）［1］。維生素在Hcy的代謝過程中起到很重要的調(diào)節(jié)作用，除此之外運(yùn)動、飲食習(xí)慣、性別和年齡都對Hcy的水平有顯著的影響［2］。當(dāng)生物體內(nèi)的一些關(guān)鍵酶基因被改變時，Hcy的代謝途徑會受到影響，導(dǎo)致Hcy增多，血液中Hcy處于高水平狀態(tài)，稱作高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy），我國一般將空腹總Hcy血漿濃度＞10μmol/ L定義為HHcy［3］。高濃度的Hcy通過MAPK/ERK激酶1/2和核因子κB來降低ApoE的表達(dá)［4］，是許多疾病的危險因子，特別是冠狀動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、中風(fēng)和癡呆等心腦血管疾病，并且它還會導(dǎo)致肥胖、糖尿病、慢性腎炎以及神經(jīng)組織退化性疾?。?-7］。除此之外，血漿Hcy濃度還與嚴(yán)重腦損傷和預(yù)后情況、細(xì)胞的衰老以及肢干發(fā)育有關(guān)［8，9］。因此，Hcy的檢測疾病的控制和治療具有重大的意義。本文就對近年來有關(guān)Hcy所提出的一些新的檢測方法以及Hcy在某些疾病中的臨床意義做出綜述如下。

1 Hcy的檢測方法

1.1 放射酶分析法放射酶分析法是最早應(yīng)用于測定血漿中Hcy的方法，其原理是Hcy在相關(guān)水解酶作用下，與14C標(biāo)記的腺苷反應(yīng)，生成具有放射性的S-腺苷-L-Hcy，然后在高效液相色譜技術(shù)下進(jìn)行定量分析。該方法敏感性和特異性均尚可，能夠檢測出尿液標(biāo)本中Hcy濃度，但操作方法較繁瑣，檢測試劑具有放射污染，對人體有危害，因此這限制了該方法的推廣使用。

1.2 氨基酸分析儀檢測法該方法的檢測原理主要為：標(biāo)本經(jīng)過二硫蘇糖醇或者2-巰基乙醇還原后，直接在氨基酸分析儀上進(jìn)行檢測，檢測方式為茚三酮反應(yīng)。該方法耗時長，靈敏度低，并且對含硫氨基酸不敏感，因此臨床上基本不采用此方法檢測血漿Hcy［10］。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）利用GC-MS聯(lián)用檢測血漿Hcy是由Stabler等在1987年首先報道的［11］，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，并且重復(fù)性較好。然而由于其要求的設(shè)備先進(jìn)、價格昂貴，并且操作十分復(fù)雜，耗時較長，因此在臨床化學(xué)實驗室中難于普及。

1.4 高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜法檢測Hcy是近年來應(yīng)用最廣泛的的方法之一，包括熒光法和電化學(xué)法，其中最常用的是柱前衍生化熒光法。自從1993年Fiskerstrand等首次采用HPLC法檢測Hcy后［12］，經(jīng)過不斷改進(jìn)和完善，該方法具備了良好的敏感性、精確度和特異性，加快了樣本的檢測速度，并且能夠檢測血漿、尿液、內(nèi)腔積液等樣本中的Hcy濃度［13］。該方法的關(guān)鍵步驟是熒光的標(biāo)記，目前常用的熒光標(biāo)記物主要有熒光探針和染料。

1.4.1 P-acid-aldehyde（P-CHO）熒光探針（P-CHO）是一種高敏感性和選擇性的熒光探針，可用于檢測Hcy。這一類探針主要利用醛基與巰基結(jié)合，形成一個穩(wěn)定的π鍵共軛物質(zhì)，從而達(dá)到檢測到效果。這種方法可以在有其他氨基酸干擾的條件下高選擇性地檢測出Hcy，已經(jīng)被成功應(yīng)用于活細(xì)胞中Hcy的檢驗［14］。

1.4.2 DPP-AC熒光探針DPP-AC是一種基于吡咯并吡咯二酮（diketopyrrolopyrrole，DPP）和丙烯酸脂acrylate的熒光探針，可用于檢測生物體內(nèi)的巰基，具有高選擇性和高敏感性。DPP-AC依靠丙烯酸脂的強(qiáng)電子吸附能力來改變熒光的參比率，其中I552/I664的熒光參比率的改變高達(dá)20倍。它可以在活細(xì)胞中很好的將Hcy區(qū)分出來［15］。

1.4.3 熒光素tri-aldehyde熒光素tri-aldehyde被設(shè)計用于檢測人血漿中的Hcy，它同樣通過PET來對樣品進(jìn)行區(qū)分，這種方法具有很高的靈敏性和選擇性。在pH=6.0的條件下，在3個強(qiáng)電子吸附基團(tuán)——醛基的存在下，熒光素能更好地與Hcy反應(yīng)，從而提高Hcy的檢測限［16］。

1.4.4 BODIPY熒光染料BODIPY是一種高色度選擇性的熒光染料，可用于檢測Hcy。與其他方法所不同的是，它是一種“裸眼染料”，在methanol-HEPES buffer溶液中，這種染料能將Hcy從其他氨基酸以及含巰基物質(zhì)中鑒別出來從而用于Hcy的活細(xì)胞成像［17］。

1.5 循環(huán)酶法由于Hcy檢測試劑盒的逐步市場化和大眾化，全自動生化儀上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床中Hcy的檢測。其原理主要是：樣本中結(jié)合的Hcy被還原成游離的Hcy，然后在相關(guān)酶作用下最終分解成Hcy和丙酮酸，丙酮酸參與NADH的顯色反應(yīng)，而生成的Hcy再次循環(huán)至第一步反應(yīng)，最終Hcy的含量與NADH的變化成正比。由于全自動生化儀的發(fā)展，循環(huán)酶法檢測Hcy更加方便，操作簡答，成本也較低，重復(fù)性好，因此具有廣泛的應(yīng)用前景［18］。

1.6 其他方法常見的Hcy檢測方法還包括ELISA法、熒光偏振免疫法和高效毛細(xì)管電泳法，但這些方法靈敏度、特異性均不理想，并且操作較復(fù)雜，因此目前臨床上已較少使用，趨于淘汰［19，20］。

2 Hcy在臨床中的應(yīng)用

2.1 Hcy與冠狀動脈粥樣硬化有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素，高濃度的Hcy能提高同型半胱氨酸蛋白糖濃度，進(jìn)而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，形成動脈粥樣硬化［21］。Hcy參與動脈粥樣硬化的機(jī)制目前尚未完全明確，但可能與其誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、加速血栓形成、促脂質(zhì)氧化、促血管平滑肌細(xì)胞及促炎癥反應(yīng)有關(guān)［22］。因此檢查患者Hcy血漿濃度對冠狀動脈粥樣硬化的預(yù)防和診斷具有重要的意義。

2.2 Hcy與腦血管疾病當(dāng)體內(nèi)的Hcy水平代謝出現(xiàn)紊亂時，高濃度的Hcy可與低密度脂蛋白形成復(fù)合體，堆積于血管內(nèi)，并且Hcy可發(fā)生自發(fā)氧化形成超氧化物，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終引起心腦血管疾病。大量研究表明，高Hcy與腦血管疾病的發(fā)生具有相關(guān)性［3，23，24］。Hcy濃度高的患者患腦卒中的概率要明顯高于Hcy濃度正常者［25-27］。

2.3 Hcy與神經(jīng)組織退化性疾病Hcy是一種含硫的促炎癥氨基酸，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病時，比如肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），Hcy的濃度會顯著上調(diào)。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為，高濃度Hcy通過增加氧脅迫來導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾?。?8］。Letizia Polito等人的研究表明，總同型半胱氨酸水平對老年人的認(rèn)知受損有影響，高水平的Hcy可能與執(zhí)行功能受損有關(guān)，并且高濃度Hcy會導(dǎo)致一些危險的神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，從而損傷認(rèn)知功能［29］。

2.4 Hcy與腎病高水平的Hcy能夠通過增加血管氧脅迫壓力，并降低機(jī)體的抗氧化能力，從而導(dǎo)致慢性腎炎的發(fā)生。有研究表明，較健康人而言，慢性腎炎患者體內(nèi)有更多的丙二醛以及更強(qiáng)的抗氧化潛力，但是抗氧化酶的活性卻顯著性下降；高濃度的Hcy以及丙二醛會增加病人患慢性腎炎的風(fēng)險［30］。Chico等人的研究表明，非胰島素依賴型糖尿病病人Hcy水平高于對照組，并得出糖尿病病人空腹Hcy升高和白蛋白排泄率增高有關(guān)［31］。因此，監(jiān)測Hcy水平對腎病的預(yù)防與治療也是十分必要的。

2.5 Hcy與冠心病高濃度的Hcy能夠抑制脂蛋白合成，增加機(jī)體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇，進(jìn)而抑制膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高動脈粥樣硬化的危險性［32］。有研究表明，在冠心病患者體內(nèi)，血漿腺苷濃度、Hcy濃度以及血尿酸濃度要顯著高于健康者，并且腺苷濃度與Hcy和血尿酸濃度具有相關(guān)性［33］。但腺苷到底如何參與疾病的調(diào)控或者說他是否是一種保護(hù)性調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。

2.6 Hcy與肥胖有研究表明，Hcy濃度還與肥胖有關(guān)，研究中作者選取了238名3歲左右的孩子，對他們身體的各項指標(biāo)進(jìn)行了監(jiān)測與評估，發(fā)現(xiàn)Hcy水平與患者肥胖程度相關(guān)［34］。這項研究為肥胖的治療提供了一種新的思路——在早期就對肥胖的潛在患者進(jìn)行Hcy濃度的干預(yù)。楊帆等人的研究也表明，Hcy水平升高能改變肝臟的脂肪代謝，從而影響肥胖的產(chǎn)生［35］。

2.7 Hcy與缺鐵性貧血羅小琴等人發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重的高Hcy血癥患者，會出現(xiàn)缺鐵性貧血以及過量鐵離子在肝臟中沉淀。于是她們在HepG2細(xì)胞中對Hcy影響鐵調(diào)素的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示鐵調(diào)素的翻譯以及蛋白的表達(dá)對Hcy呈現(xiàn)出一種劑量依賴性［36］。這也為難治性缺鐵性貧血提供了新的治療思路。

小結(jié)

同型半胱氨酸在人體內(nèi)具有重要的生理功能，包括參與甲硫氨酸代謝、調(diào)節(jié)體內(nèi)甲基化等，但異常濃度的Hcy與心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎病等疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系。其中，高Hcy血癥已被大家公認(rèn)是心腦血管疾病的一個危險因素。Hcy的檢測手段也多種多樣，目前應(yīng)用較為廣泛的方法主要有高效液相色譜法以及循環(huán)酶法。隨著全自動生化分析儀的發(fā)展和普及，循環(huán)酶法檢測Hcy已成為臨床中最為方便、實用，這也為Hcy檢測的臨床常規(guī)化提供了必備條件，為臨床上心腦血管疾病的控制和治療提供了一定幫助。

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R446.11+2

A

1674-1129（2016）05-0601-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.020

2016-05-05；

2016-08-24）

曾風(fēng)華，女，1974年3月出生，主管技師，主要研究方向臨床生物化學(xué)診斷。

王小中，男，1973年12月出生，教授，主要研究方向為血液病分子機(jī)制及診斷。