劉堯娟，王貫喬，王樹森，2，3（.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)院重點實驗室，天津30000；2.天津市第一中心醫(yī)院移植中心，天津 30092；3.天津市器官移植重點實驗室，天津 30092）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一種器官特異性的免疫性疾病，近年來，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)尤其是兒童中處于上升趨勢。T1DM可能是由于特殊致病基因的改變，一種或多種環(huán)境因素導(dǎo)致，但具體病因仍不能確定。大量研究顯示，T1DM主要發(fā)病機制是自身免疫性T細胞攻擊釋放胰島素的β細胞［1］。T1DM患者依賴于外源性胰島素治療，但常發(fā)生嚴重的低血糖或胰島素劑量不足而導(dǎo)致的高血糖，疾病后期常發(fā)生嚴重并發(fā)癥（微血管和大血管疾?。┥踔了劳觯?］。

由于T1DM多出現(xiàn)于兒童早期，所以疾病帶來的痛苦將伴隨患者終身，同時為個人、家庭和社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔。臨床資料顯示，糖尿病患者糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbAlc）小于7.0%時可減少微血管和大血管疾病的發(fā)生，但大量臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，僅13%～15%的患者能夠達到這個目標［3］。近年來，盡管在胰島素種類、動態(tài)血糖監(jiān)測、胰島素泵等方面取得了重大進步，再加上嚴格的代謝控制、規(guī)范的血糖控制（HbAlc＜6.9%），T1DM患者的病死率仍是對照組的2倍［2，4］。這些研究結(jié)果提示我們，應(yīng)在患者高血糖發(fā)生之前對其進行個體化干預(yù)或?qū)1DM初發(fā)病患者的剩余胰島細胞進行保護，更進一步，則是通過移植匹配的同種異體胰島、自體干細胞分化及刺激β細胞體外增殖等方法，使一些體內(nèi)有很少或幾乎沒有功能性胰島的T1DM患者的β細胞功能得到修復(fù)［5］。但要長期保存T1DM患者的胰島功能，還需要通過各種免疫干預(yù)方式來抑制其自身免疫反應(yīng)。

1 免疫病理

T1DM是一個自身免疫過程［6］∶人白細胞抗原易感基因可能導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）多肽與自身T細胞受體（T cell receptor，TCR）結(jié)合力改變，引起自身反應(yīng)性T細胞從胸腺逃逸，即無法獲得中樞耐受，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而引發(fā)T1DM［7］。然而在健康對照組外周血中仍然可以發(fā)現(xiàn)自身反應(yīng)性T細胞，表明T1DM還存在其他發(fā)病機制［7］。T1DM的自身免疫過程受遺傳和環(huán)境因素影響［6］，其中外周免疫耐受缺陷是導(dǎo)致此過程的重要因素。外周免疫耐受缺陷由許多原因?qū)е碌?，包括與T1DM相關(guān)的編碼白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-2受體的α亞基、CTLA4和轉(zhuǎn)錄因子FoxP3基因。Coppieters等［8］研究發(fā)現(xiàn)，機體外周免疫耐受監(jiān)測點的某些基因缺陷導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細胞活化，使胰島受到免疫性攻擊，出現(xiàn)T1DM的特征性病變胰島素炎，誘發(fā)T1DM。

2 免疫干預(yù)靶點

隨著T1DM的免疫病因?qū)W逐漸明確，研究者采用了一些非特異性免疫抑制劑，包括環(huán)孢素、咪唑硫嘌呤和潑尼松等來治療T1DM，盡管有一定的療效，但由于免疫抑制伴隨的嚴重不良反應(yīng)致使這些臨床試驗被終止［9］。中樞及外周的免疫耐受缺陷導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的出現(xiàn)，T細胞（CD4+和CD8+）被激活，破壞大量胰島β細胞，使T細胞成為免疫干預(yù)的重要靶點。在T1DM中效應(yīng)T細胞（effector T cell，Teff）通過抑制調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）的功能導(dǎo)致β細胞凋亡。另外，除了常規(guī)的T細胞外，抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs），包括B細胞、單核/巨噬細胞和樹突細胞及T1DM免疫病理學(xué)相關(guān)的可溶性介質(zhì)，也可成為潛在的免疫干預(yù)靶點。隨著對免疫疾病的深入研究和治療方法的巨大進步，尤其是靶向T細胞、B細胞及各種細胞因子表面受體的融合蛋白及單克隆抗體的出現(xiàn)，使靶向免疫干預(yù)治療T1DM成為可能。本文將著重介紹與T細胞相關(guān)的已經(jīng)應(yīng)用于臨床或可能應(yīng)用于臨床的免疫干預(yù)方法。

3 針對T細胞的免疫干預(yù)治療

3.1 共刺激分子阻斷劑∶共刺激分子是T細胞與抗原首次接觸后，再次被激活的重要信號，是連接固有免疫和獲得免疫的橋梁。表達抗原肽-MHC復(fù)合物的APCs與相應(yīng)的T細胞接觸后，T細胞表面的TCR可同時識別MHC和結(jié)合于MHC分子溝槽里的抗原肽，從而提供T細胞活化的第一信號。然而T細胞激活還需要APCs表面的共刺激分子作為第二信號，如果沒有共刺激分子，T細胞將不能活化甚至凋亡。經(jīng)典通路的受體配體是由APCs表面的CD80/CD86（B7-1/B7-2）和天然CD4+和CD8+T細胞表面的CD28組成。T細胞被活化后，表面表達第2種CD80/CD86受體-CTLA4分子，其不同于CD28，具有抑制功能。由于多種共刺激和共抑制信號通路的發(fā)現(xiàn)，許多具有干預(yù)作用的藥物問世［10-13］。針對共刺激通路開發(fā)的靶向藥物CTLA4-Ig融合蛋白（阿貝西普）［14］，作為可溶性受體與CD80/CD86結(jié)合，阻斷CD80/CD86-CD28共刺激信號通路，已被應(yīng)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［15］。治療初發(fā)T1DM的研究表明，阿貝西普治療后，6個月內(nèi)患者C肽分泌量正常，之后的2年內(nèi)療效較對照組無顯著差異，另外，對外周T細胞亞群進行流式細胞學(xué)分析，其結(jié)果無明顯變化，但發(fā)現(xiàn)大量初始CD4+T細胞增殖和中央記憶CD4+T細胞減少，這同C肽分泌量的結(jié)果相符［16-17］。與我們預(yù)想的一致，盡管反應(yīng)速度比預(yù)期慢，但從治療開始，一些主要調(diào)節(jié)C肽反應(yīng)的Treg數(shù)量出現(xiàn)減少趨勢，然而Treg控制APCs的功能是通過其細胞表面CTLA4調(diào)控的這個機制并沒有在本實驗中得到驗證。盡管如此，阿貝西普通過阻斷共刺激通路治療T1DM這一思路是可行的，并有待進行深入研究。同時，阿貝西普用于預(yù)防T1DM高危人群的試驗?zāi)壳耙苍谶M行中。

3.2 特異性抗原治療∶針對免疫耐受治療更有意義的是抗原特異性治療。具體的方案是在自身免疫疾病中對特異性致病抗原（自身抗原）進行有針對性的特異性治療［18］。如果自身抗原出現(xiàn)在耐受性的環(huán)境中，與耐受性的APCs結(jié)合或結(jié)合相應(yīng)的共抑制信號，使得自身反應(yīng)性Teff下調(diào)并且伴隨著抗原特異性Treg上調(diào)。由于不需要廣泛的免疫抑制，并且可以反復(fù)進行治療，因此，這種治療方案得到了更多研究者的認可。

盡管經(jīng)過幾十年來不斷努力，但免疫干預(yù)治療的進展并不理想，在一些治療方式中甚至出現(xiàn)患者病情加重的現(xiàn)象［19］。目前，治療所面臨的障礙包括∶治療藥物劑量、臨床路徑、誘導(dǎo)劑、給藥途徑及給藥頻率。由于在T1DM中特異性抗原治療缺乏規(guī)范，近年來治療效果不佳［20］。然而最近一項關(guān)于DNA質(zhì)粒編碼胰島素原的初期研究結(jié)果顯示，在1～4次劑量治療中，15周內(nèi)C肽的分泌量沒有變化，此后C肽的分泌量較對照組無顯著差異，且發(fā)現(xiàn)C肽的數(shù)量保留與胰島內(nèi)特異性CD8+T細胞浸潤減少有很大相關(guān)性［21］。盡管這次因?qū)嶒灅颖具^少無法得出令人信服的結(jié)論，但此結(jié)論卻給我們很大的提示∶如果在T1DM治療中給予合適的劑量，可能會得到令人滿意的結(jié)果。特異性抗原治療還包括聯(lián)合其他藥物治療需要完成［22］。

3.3 T細胞耗竭∶早期免疫干預(yù)治療中，用抗胸腺細胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）聯(lián)合激素治療初診斷的T1DM，在改善患者HbAlc水平和減少胰島素用量方面取得了很好的療效［23］，但經(jīng)過12個月的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ATG治療組并未出現(xiàn)顯著的治療效果，并且研究數(shù)據(jù)顯示ATG治療組C肽分泌量前6個月較后6個月有加速減少的跡象［24］。在干預(yù)治療過程中發(fā)現(xiàn)，所有研究對象在給藥7～10天后釋放細胞因子，血清中短暫出現(xiàn)大量IL-6和急性蛋白反應(yīng)，表明存在負向免疫調(diào)節(jié)。另有研究表明，進一步免疫活化是T1DM惡化的機制，需通過IL-2聯(lián)合雷帕霉素進行治療［25］。

3.4 T細胞調(diào)節(jié)∶在T1DM或大多數(shù)自身免疫性疾病中，為了盡量保持Treg和Teff的平衡，一種方法是耗竭相關(guān)自身反應(yīng)性Teff；另一種方法是通過調(diào)節(jié)Teff，使其處于低反應(yīng)狀態(tài)，如提高T細胞的無效性、耗竭或早衰［26］。通過阻斷共刺激通路導(dǎo)致T細胞無效反應(yīng)也是一種干預(yù)手段。合理有效的干預(yù)應(yīng)該是耗竭Teff或使其無反應(yīng)性與增強Treg的功能有效結(jié)合［22］。

在初診斷的T1DM中，可通過T細胞進行靶向治療，CD3單克隆抗體即TCR復(fù)合物的一部分來維持C肽的分泌。Herold等［27］在初發(fā)病的T1DM患者中應(yīng)用Fc無鏈受體hOKT3γ1（Ala-Ala）抗CD3抗體（后來命名為teplizumab），發(fā)現(xiàn)其具有保護C肽功能、降低HbAlc水平和胰島素用量的作用。該研究結(jié)論同樣被一個歐洲團隊用另一種抗CD3抗體（otelixizumab）證實［28］。這 2個團隊的研究結(jié)果均表明，CD3抗體在部分患者中的治療效果可以維持3年以上［29-30］。然而相當一部分接受此種治療方式的患者在服藥期間出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征和EB病毒活化或EB病毒相關(guān)的疾病［31］，隨后大量實驗都以失敗告終，部分原因是選擇劑量過低［32-33］。這些結(jié)果令人惋惜但也為免疫干擾的進一步研究提供了必要線索。

在Teplizumab的2期臨床試驗中，接受第2次藥物治療12個月后，與對照組相比，實驗組患者的C肽分泌維持了24個月，這可能是由于抗體阻斷自身免疫從而誘導(dǎo)早期T1DM耐受，即部分治療有效的患者C肽能夠得到非常好的保護，而治療無效的患者則觀察不到任何變化［34］。然而Teplizumab的基礎(chǔ)藥物反應(yīng)和活性機制尚不清楚。在早年的研究中，特別是在非肥胖糖尿病動物模型中發(fā)現(xiàn)，CD3抗體治療可以選擇性耗竭致病性T細胞同時保護Treg，但這一機制并沒有在人類研究中得到驗證［35］。研究發(fā)現(xiàn)，治療有效的患者CD4+/CD8+T細胞比值下降［27，29］，與最近發(fā)現(xiàn)的延期治療患者（非初發(fā)病的T1DM患者）中央記憶性CD8+T細胞升高的結(jié)果一致［36］。盡管CD8+T細胞總數(shù)增加與預(yù)期不符，但這可能暗示抗CD3有部分激動效應(yīng)，誘導(dǎo)不同類型Teff的調(diào)控。

最近，另一種治療初發(fā)T1DM的T細胞調(diào)節(jié)藥物阿法賽特正在評估。阿法賽特是一種針對T細胞的靶向CD2共刺激通路的LFA3-Ig融合蛋白。CD2在大部分淋巴細胞表面表達，但在Teff和記憶性T細胞表面不表達。早期關(guān)于銀屑病的研究發(fā)現(xiàn)，阿法賽特能夠選擇性的靶向作用于效應(yīng)性記憶T細胞，其機制可能與T細胞亞群部分耗竭，調(diào)控CD2介導(dǎo)的共刺激通路有關(guān)［37］。在銀屑病的治療中，2次或多次使用阿法賽特治療后病情能夠得到長期緩解，這可能是免疫耐受的一種形式［38］。初發(fā)病的T1DM用阿法賽特進行了2次12周的療程，發(fā)現(xiàn)C肽保留、胰島素用量顯著下降，且與對照組相比，12個月內(nèi)嚴重低血糖的發(fā)生率降低了50%，這提示對于初發(fā)病的T1DM患者來說，應(yīng)用阿法賽特治療可緩解病情［39］。

通過流式細胞術(shù)對阿法賽特治療組的T細胞亞群分析發(fā)現(xiàn)，中央和效應(yīng)性記憶CD4+和CD8+T細胞顯著減少，Treg得到保存，Treg/Teff比值顯著升高，臨床療效明顯。值得關(guān)注的是阿法賽特誘導(dǎo)T細胞改變的現(xiàn)象，包括降低T細胞的無反應(yīng)性和/或部分興奮作用，這些都已經(jīng)在人外周血單核細胞（peripheral blood monouclear，PBMC）［40］的體外試驗中得到證實。由于沒有發(fā)生哺乳動物相關(guān)的嚴重不良事件，阿法賽特可能是一種合適作用于T1DM患者甚至兒童患者的干擾免疫調(diào)節(jié)治療藥物［39］。

3.5 Treg的增殖∶早期報道表明，可通過減少Teff或增加Treg來改善自身免疫疾病中的免疫平衡。雷帕霉素聯(lián)合IL-2治療初發(fā)病T1DM的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組外周Treg數(shù)量和pSTAT5信號表達水平顯著高于正常對照組［25］。然而，即使存在這些顯著的變化，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)可能由于外周自然殺傷細胞和嗜酸粒細胞的大量增多和其他形式的免疫活化導(dǎo)致病情迅速惡化（C肽急劇下降）［25］。雷帕霉素在抑制Teff活性的同時，可能對β細胞具有毒害作用或在某些環(huán)境下出現(xiàn)抗耐受性。同時低劑量IL-2治療T1DM的實驗還在進行［41-42］，需探索出不僅能夠使Treg增殖還能夠抑制Teff活化的應(yīng)用劑量。

另一種增加Treg的方法是通過移植自體擴增Treg。近年來，這種方法已受到廣泛關(guān)注，并且正在應(yīng)用于T1DM的治療中［43］。最近報道表明，初發(fā)病的T1DM患者輸注自體Treg，部分患者C肽保留超過1年［44-45］，但現(xiàn)階段此干預(yù)方式的有效性和安全性仍不能肯定。目前，人們更關(guān)心的是Treg的穩(wěn)定性和可塑性［46］及在自身免疫環(huán)境中Treg向Teff致病性轉(zhuǎn)化的潛能［47］。為保證Treg輸注后的穩(wěn)定性，必須同時服用IL-2以提高其穩(wěn)定性和抑制功能。

4 總 結(jié)

通過對相關(guān)研究的總結(jié)和分析，我們已經(jīng)對T1DM的免疫機制有了深刻的了解，也更詳細的了解了通過T1DM免疫機制進行的免疫干預(yù)療法，包括免疫干預(yù)的靶向識別、非特異性免疫抑制藥物的臨床研究、靶向生物制劑甚至細胞治療的研發(fā)和應(yīng)用等，其中一些干預(yù)有潛力應(yīng)用于臨床治療中。應(yīng)更加強調(diào)根據(jù)機制進行免疫耐受的藥物聯(lián)合應(yīng)用，同時β細胞在T1DM中的作用也需要受到重視。

不同于干細胞或者藥物誘導(dǎo)細胞再生，一旦免疫耐受被重新恢復(fù)，長期保留剩余的β細胞或保持移植后β細胞接近正常水平將可以實現(xiàn)。鑒于以上諸多原因，進一步優(yōu)化免疫干預(yù)方式將成為今后T1DM免疫治療研究的重點。