李紅娜,袁　飛,周偉娥,羅云敬,張　峰，*,李紹輝

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;2.北京工業(yè)大學(xué),北京 100124)

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副溶血弧菌檢測方法研究進(jìn)展

李紅娜1,2,袁飛1,周偉娥1,羅云敬2,張峰1，*,李紹輝1

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;2.北京工業(yè)大學(xué),北京 100124)

副溶血弧菌是海產(chǎn)品中常見致病菌,可引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等疾病。由于我國是海產(chǎn)品消費(fèi)大國,所以必須建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法監(jiān)測海產(chǎn)品中的副溶血弧菌。目前主要應(yīng)用分子生物學(xué)方法和分析化學(xué)方法,從細(xì)胞水平和分子水平來檢測副溶血弧菌,主要包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS),這兩種方法可以對副溶血弧菌進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量,是檢測食品中副溶血弧菌的快速、特異、靈敏的方法,可用來評估和監(jiān)管海產(chǎn)品污染副溶血弧菌的風(fēng)險(xiǎn),保證人們的飲食安全。

食品安全,副溶血弧菌,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

副溶血弧菌是海產(chǎn)品引起食物中毒的常見病原菌,適合生長的溫度范圍為15～44 ℃,-20～10 ℃容易死亡[1]。吳永寧等[2]對中國2003～2008年間的由副溶血弧菌食源性致病菌引發(fā)的食物中毒事件進(jìn)行了總結(jié),該致病菌可引起人急性腸胃炎,使人發(fā)生惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀[3],副溶血弧菌引起人食物中毒常發(fā)生在4月到10月份,常見引起食物中毒食物為肉及肉制品、海產(chǎn)品等,通常表現(xiàn)為交叉污染。副溶血弧菌引起人類疾病的途徑除了飲食外,還可以通過皮膚接觸產(chǎn)生,如人類皮膚接觸到被副溶血弧菌感染的水后會(huì)引起傷口感染、腸胃炎或者敗血癥等[4],因此對于副溶血弧菌的監(jiān)測除了市場上流通的海產(chǎn)品,還需對娛樂水域的水環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測。

耐熱直接溶血素(TDH)和耐熱直接相關(guān)溶血素(TRH)是副溶血弧菌的兩個(gè)主要的毒力因子,這兩種物質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似,都由二聚體構(gòu)成,并有相似的溶血活性,維持二聚體結(jié)構(gòu)是保持溶血活性必不可少的[5]。經(jīng)腹腔注射表明,只有具有溶血活性的菌株具有毒性[6]。Sadok Khouadja等[7]研究表明,非致病性的副溶血弧菌可能是毒力基因庫,可水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生新的致病菌,為保證人們的飲食健康和生命安全,需要建立快速、準(zhǔn)確、行之有效的方法對致病性副溶血弧菌及非致病性副溶血弧菌進(jìn)行全面監(jiān)測。

本文對近幾年副溶血弧菌的檢測方法進(jìn)展進(jìn)行了概括,為保障人們的飲食衛(wèi)生和娛樂水域安全提供保障。

1　菌體檢測

食品中對于菌體的檢測的目的是對菌落進(jìn)行定量或者定性,菌體的檢測方法主要有平板計(jì)數(shù)法、生化實(shí)驗(yàn)法、菌落雜交法、質(zhì)譜法及免疫層析法。其中平板計(jì)數(shù)法屬于定量方法,生化實(shí)驗(yàn)法屬于定性方法,菌落雜交和免疫層析法屬于定性及半定量法,質(zhì)譜法屬于定性和完全定量法。

1.1平板菌落計(jì)數(shù)法

將樣品研磨并配成溶液,稀釋一定的濃度梯度,采用傾注法或者涂布法將樣品接種于培養(yǎng)基上,在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng),一定稀釋倍數(shù)的樣品中的細(xì)菌可單個(gè)分散在平板上形成肉眼可見的菌群,菌群的數(shù)量代表細(xì)菌總數(shù),這里的菌落總數(shù)是指符合該培養(yǎng)條件的菌的總數(shù),不是絕對的活菌數(shù)量。細(xì)菌在存活非培養(yǎng)狀態(tài)時(shí)不能形成菌落，可能會(huì)造成檢測的菌落總數(shù)低于實(shí)際菌落總數(shù)[8]。

1.2生化實(shí)驗(yàn)法

根據(jù)菌種的生理生化及表觀特征對菌種進(jìn)行鑒定,是微生物鑒定的常用方法,目前全自動(dòng)微生物鑒定儀已經(jīng)成為一套成熟的微生物鑒定系統(tǒng)。典型的副溶血弧菌在硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落,具有氧化酶陽性、賴氨酸脫氫酶陽性、硫化氫陰性、有動(dòng)力、發(fā)酵葡萄糖和甘露醇、不發(fā)酵蔗糖和乳糖等生化特征[9]。與MALDI-TOF MS和16S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相比,全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK2只能對菌屬進(jìn)行準(zhǔn)確定性而不能準(zhǔn)確區(qū)別菌種。VITEK微生物鑒定儀是根據(jù)微生物的生理生化特征進(jìn)行鑒別微生物,而同一菌屬之間的菌種生化特征差別不大,因而在菌種鑒別上受到很大限制,數(shù)據(jù)庫的存儲(chǔ)的菌種數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步擴(kuò)充和更新[10-12]

1.3菌落雜交法

基于菌種的特異性基因設(shè)計(jì)探針,用放射性同位素或者熒光物質(zhì)標(biāo)記探針,通過裂解細(xì)菌使探針與細(xì)菌特異性基因結(jié)合,通過檢測信號判斷陽性或者陰性。Elisabetta Suffredini等[13]建立了菌落雜交法對總副溶血弧菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。采用異羥基洋地黃毒甘標(biāo)記4種探針,tdh1、tdh2、trh1和trh2,檢測了70株標(biāo)準(zhǔn)菌株和356株從環(huán)境、食品和臨床分離得到的菌株,特異性能達(dá)到100%,線性相關(guān)系數(shù)在0.895～0.987之間。采用菌落雜交法、國際標(biāo)準(zhǔn)法和菌落計(jì)數(shù)法檢測了104個(gè)天然樣本,菌落雜交法和國際標(biāo)準(zhǔn)法的準(zhǔn)確度可達(dá)到86.7%,菌落雜交法可替代菌落計(jì)數(shù)法檢測海產(chǎn)品中的致病性副溶血弧菌。J R López等[14]建立了反向線點(diǎn)雜交技術(shù)檢測黃桿菌屬、弧菌屬、發(fā)光桿菌屬及假單胞菌。根據(jù)16-23S基因間隔區(qū)的特異性片段或者23S rRNA的特異性片段制備特異性的生物探針,標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株通過反向線點(diǎn)雜交均能準(zhǔn)確鑒別,除了哈維氏弧菌的探針與坎氏弧菌擴(kuò)增產(chǎn)物有交叉反應(yīng)外,其余非目標(biāo)菌株均表現(xiàn)為陰性。這是第一個(gè)鑒別魚類細(xì)菌性病原體的反向線點(diǎn)雜交方法,對于水產(chǎn)養(yǎng)殖的流行病學(xué)研究和疾病控制具有重要意義。菌落雜交法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且可能出現(xiàn)非特異性結(jié)合的現(xiàn)象而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

1.4質(zhì)譜法

是根據(jù)待測微生物的蛋白指紋譜圖與蛋白指紋譜圖庫進(jìn)行特征比較,快速對微生物進(jìn)行定性。René Erler等[15]建立了弧菌屬的質(zhì)譜譜圖庫,檢測的準(zhǔn)確度高,而且可開放獲取,可用于海洋環(huán)境弧菌的檢測。SM Malainine等[16]應(yīng)用MALDI-TOF MS檢測貝類、海水及沉積物中副溶血弧菌,可以將特征相似的菌株進(jìn)行區(qū)分,定性準(zhǔn)確度高。

質(zhì)譜法可以準(zhǔn)確鑒定菌種之間的差異,是一種高精度定性的方法,但對于條件致病菌銅綠假單胞菌,質(zhì)譜法并不能準(zhǔn)確鑒別,所以,質(zhì)譜法也存在缺陷,數(shù)據(jù)庫有待完善[17]。

1.5免疫層析法

通過菌體表面的特異性抗原制備得到單克隆抗體,然后將抗體固定于載體表面,根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合產(chǎn)生顯色反應(yīng),檢測樣品中是否含有目標(biāo)抗原。Junko Sakata等[18-19]建立了免疫層析法檢測平板上的副溶血弧菌,檢測了124株副溶血弧菌、94株其他弧菌及35株非弧菌屬菌株,均可以準(zhǔn)確鑒定。針對副溶血弧菌的F0F1 三磷酸腺苷合成酶抗原得到的兩種單克隆抗體mAb-VP34和mAb-VP109,由于這些抗原為高保守區(qū)的序列產(chǎn)物,幾乎所有的副溶血弧菌都存在相同的抗原,所以這種免疫分析方法出現(xiàn)假陰性的概率很小。這種方法簡單、快速,克服了副溶血弧菌在鑒別培養(yǎng)基上出現(xiàn)不同顏色反應(yīng)的缺點(diǎn),而且常規(guī)的生化檢測需要至少3 d時(shí)間,免疫層析法只需30 min就可得到檢測結(jié)果。免疫層析法操作較為復(fù)雜,主要表現(xiàn)在單克隆抗體制備的環(huán)節(jié),也可能因?yàn)樾瓮目乖砦欢霈F(xiàn)交叉反應(yīng),出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2　基因檢測

根據(jù)菌體的特異性基因片段對菌種進(jìn)行檢測和鑒定,是一種特異性強(qiáng),耗時(shí)短,靈敏度高的分子生物學(xué)方法,應(yīng)用廣泛。

2.1基因探針法

基因探針是根據(jù)待測菌種的特異性基因片段制備的互補(bǔ)配對的寡核苷酸鏈,基因探針需用放射性元素或者熒光標(biāo)記,根據(jù)檢測標(biāo)記信號判斷待測樣品中是否含有目標(biāo)基因。多個(gè)基因探針整合在一起,制成基因芯片可以同時(shí)檢測多種基因,是一種高通量方法。Yu-Ri Kim等[20]采用DNA陣列雜交法將弧菌屬進(jìn)行了分類,DNA陣列由23個(gè)弧菌屬的分子伴侶groESL基因間隔區(qū)的非轉(zhuǎn)錄基因片段組成,DNA陣列雜交可以準(zhǔn)確區(qū)分副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌。

2.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

根據(jù)目標(biāo)菌的標(biāo)志性基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行體外擴(kuò)增,然后用EB染料對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行染色,進(jìn)行葡聚糖凝膠電泳,在紫外成像儀下觀察電泳條帶,判斷待測樣品是陰性還是陽性。Muhammad Tofazzal Hossain等[21]采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測和鑒別副溶血弧菌,引物設(shè)計(jì)的對象為生物特異性標(biāo)志物,分子伴侶groEL、耐熱直接溶血素tdh和耐熱直接相關(guān)溶血素trh,經(jīng)過人工污染樣品檢測表明該方法可用于快速檢測和鑒別副溶血弧菌分離菌株。Mohammadjavad Paydar等[22]建立了傳統(tǒng)PCR結(jié)合基因外重復(fù)回文序列PCR技術(shù)來檢測和鑒別副溶血弧菌。多重PCR檢測編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白基因gyrB和管家基因pntA,可以有效篩選副溶血弧菌,而REP-PCR可以對不同血清型進(jìn)行鑒別。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

與普通PCR相比,省去了用EB染色的部分,操作更加安全;實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)結(jié)果,避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象;可以對菌種進(jìn)行絕對定量。Annick Robert-Pillot等[23]建立了以水解探針為目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)來檢測和鑒定副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌及霍亂弧菌,這種方法特異性強(qiáng),可用于海鮮中弧菌類致病菌的檢測。Min-Hee Kang等[24]建立了2步快速實(shí)時(shí)熒光PCR檢測副溶血弧菌的耐熱直接溶血素基因tdh,這種方法所需樣品量少,特異性強(qiáng),準(zhǔn)確率高,是目前檢測副溶血弧菌的最快的方法。Alejandro Garrido等[25]采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測水和海產(chǎn)品中的副溶血弧菌。目標(biāo)基因?yàn)閠hd、trh1和trh2,檢測限分別為6、11、8 cfu/25 g。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 21872-1:2007檢測總副溶血弧菌需要至少3 d時(shí)間,而多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測及鑒別副溶血弧菌只需24 h。這種方法是實(shí)用性強(qiáng)、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的高通量檢測方法。

2.4環(huán)介導(dǎo)等溫PCR

環(huán)介導(dǎo)等溫PCR是一種較為溫和核酸擴(kuò)增方法,與普通PCR相比,特異型性更強(qiáng),靈敏度更高,而且比熒光PCR成本低,所需設(shè)備簡單,應(yīng)用范圍較廣。Tan Turk Hsern Malcolm等[26]比較了環(huán)介導(dǎo)等溫PCR和多重PCR檢測海產(chǎn)品中的副溶血弧菌,結(jié)果表明,雖然這兩種方法的檢測結(jié)果區(qū)別不太,但是在樣品中目標(biāo)菌株含量較低時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法比多重PCR更具有優(yōu)勢。

3　代謝物檢測

檢測菌種的特異性標(biāo)志物,是鑒別菌種的一種重要手段,檢測的目標(biāo)主要為毒素及酶類。副溶血弧菌的主要代謝毒素為耐熱直接溶血素、耐熱直接相關(guān)性溶血素等。

3.1酶聯(lián)免疫吸附法

酶標(biāo)記抗體與固定在載體表面的抗原或者抗抗體特異性結(jié)合,用適當(dāng)?shù)娜軇_洗載體表面,去除沒有結(jié)合的酶標(biāo)抗體,然后加上酶底物,底物與酶發(fā)生顯色反應(yīng),根據(jù)顏色的深淺判斷待測樣品中是否含有待測物質(zhì)。Ballamoole Krishna Kumar等[27]建立了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測副溶血弧菌的耐熱直接溶血素TDH,由于耐熱直接溶血素和耐熱相關(guān)直接溶血素具有相似的抗原表位,所以,ELISA的方法并不能加以區(qū)別,這種方法可用于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測,就有高通量、簡單、快速的優(yōu)點(diǎn),但是需要專業(yè)人員和專業(yè)技術(shù)。

3.2基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法

是一種新興的生物質(zhì)譜,具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn),為生命科學(xué)領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測試手段。副溶血弧菌產(chǎn)生的耐熱直接溶血素(TDH)是一種成孔毒素,可以溶解真核細(xì)胞。Silke Bechlars等[28]進(jìn)行體外合成標(biāo)簽TDH,并用聚丙烯酰氨凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜及免疫學(xué)方法進(jìn)行檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)TDH的前體及衍生物均沒有溶血活性。

3.3高效液相色譜法

高效液相色譜應(yīng)用領(lǐng)域較廣,是最有效的分離分析手段,絕大多數(shù)化合物都可用高效液相色譜進(jìn)行檢測,在高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物分析方面具有明顯優(yōu)勢。Baskar Balakrishnan等[29]采用高效液相色譜方法檢測了副溶血弧菌產(chǎn)的弧菌素,高效液相方法在分離混合物方面具有很大的優(yōu)勢,可以幫助分離菌株培養(yǎng)混合物,發(fā)現(xiàn)菌株的特異性代謝產(chǎn)物,是鑒別不同菌株的有效方法。

4　展望

副溶血弧菌感染海產(chǎn)品引起食物中毒的危害巨大,目前海產(chǎn)品中檢測副溶血弧菌的有效方法多為實(shí)時(shí)熒光定量PCR,雖然檢測的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度都很高,但是所需儀器設(shè)備昂貴,檢測成本較高,環(huán)介導(dǎo)等溫PCR技術(shù)在靈敏度、特異性方面都優(yōu)于普通PCR,與實(shí)時(shí)熒光PCR相比,成本更低,是一種可替代方法。

目前檢測副溶血弧菌的方法主要是針對活菌進(jìn)行檢測,而對于副溶血弧菌的代謝毒素檢測不夠重視,副溶血弧菌的代謝產(chǎn)物耐熱直接溶血素是一種耐熱、耐胰蛋白酶的多肽,是副溶血弧菌的主要毒力因子,其檢測方法局限在免疫學(xué)方法,免疫學(xué)方法不僅耗時(shí)長,檢測靈敏度低,而且特異性較差,需要建立新的快速、準(zhǔn)確、靈敏、可靠的檢測方法檢測副溶血弧菌的毒力因子。此外,在開發(fā)有效抑制副溶血弧菌生長繁殖的抑制劑時(shí),對于菌的活性狀態(tài)的檢測也是非常有必要的,這方面的檢測技術(shù)也需要盡快建立。

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[29]Baskar Balakrishnan,Jayappriyan Kothilmozhian Ranishree,Sathish Thadikamala,et al. Purification,characterization and production optimization of a vibriocin produced by mangrove associatedVibrioparahaemolyticus[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine,2014,4(4):253-261.

Research progress of detecting methods forVibrioparahaemolyticus

LI Hong-na1,2,YUAN Fei1,ZHOU Wei-e1,LUO Yun-jing2,ZHANG Feng1,*,LI Shao-hui1

(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China;2. Beijing University of Technology,Beijing 100124,China)

Vibrioparahaemolyticuswhich can cause illness like nausea,vomit,stomachache and diarrhea etc. is ubiquitous pathgenic bacteria in seafood. China is a consumption country of seafood,it is necessary to establish rapid,accurate and sensitive method monitoringVibrioparahaemolyticusin seafood. At present,molecular biology methods and analytical chemistry methods based on cell level and molecular level include real-time PCR and MALDI-TOF MS uauslly be used to determine and quantifyvibrioparahaemolyticusin seafood,which are fast,specific and sensitive. It can be used to evaluate and supervise the risk ofVibrioparahaemolyticusin seafood and ensure the safety of people’s diet.

food security;Vibrioparahaemolyticus;real-time PCR;MALDI-TOF MS

2015-11-09

李紅娜(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：化學(xué)生物學(xué)與分子醫(yī)學(xué)，E-mail：lihongna1@163.com。

張峰(1974-)，男，博士，研究員，研究方向：分析化學(xué)，E-mail：fengzhang@126.com。

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201510038)；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014IK084)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)12-0371-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.062