李秀英，葉 云

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州646000）

β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞攝取氧化低密度脂蛋白的影響*

李秀英，葉 云

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州646000）

目的：探討β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：以RAW264.7巨噬細(xì)胞為細(xì)胞模型，MTT法檢測(cè)β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響；油紅O染色觀察β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞攝取氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein,oxLDL）的影響；Western blot檢測(cè)β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞SR-A、CD36、c-fos、c-Jun蛋白表達(dá)的影響。采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，并采用雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)估。結(jié)果：2.5～10 μg/mL β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性無(wú)影響；5 μg/mL β-葡聚糖顯著抑制巨噬細(xì)胞對(duì)ox LDL的攝取，從而減少巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成；與對(duì)照組比較，2.5～10 μg/mL的β-葡聚糖劑量依耐性降低巨噬細(xì)胞SR-A蛋白及細(xì)胞核蛋白c-Jun的表達(dá)（P＜0.05），但對(duì)CD36蛋白及細(xì)胞核蛋白c-fos表達(dá)無(wú)影響（P＞0.05）；與5 μg/mL β-葡聚糖處理組比較，c-Jun抑制劑SP600125進(jìn)一步增強(qiáng)β-葡聚糖抑制細(xì)胞SR-A蛋白表達(dá)的作用（P＜0.05）。結(jié)論：β-葡聚糖可抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成，且與抑制c-Jun/SR-A通路相關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化；細(xì)胞模型；β-葡聚糖；巨噬細(xì)胞；泡沫細(xì)胞

動(dòng)脈粥樣硬化是以動(dòng)脈壁脂質(zhì)聚集或炎癥發(fā)生為特征的慢性疾病，是不穩(wěn)定性心絞痛、心肌梗塞的主要原因[1]。巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。對(duì)氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，oxLDL)無(wú)限制的攝取是巨噬細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞的重要原因[2]。清道夫受體SR-A及CD36是巨噬細(xì)胞攝取oxLDL的主要受體[3]。大量的研究顯示，減少SR-A、CD36的表達(dá)可以抑制泡沫細(xì)胞的形成并最終延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[4]。

β-葡聚糖主要來(lái)源于新鮮的食品如燕麥、啤酒、酵母、食用菌等。研究顯示，β-葡聚糖具有降低血脂、抗過(guò)氧化、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5]，但具體機(jī)制不詳細(xì)。此外，有研究表明，c-Jun、c-fos與泡沫細(xì)胞的形成相關(guān)[2]。本研究擬從SR-A、CD36、c-Jun、c-fos蛋白表達(dá)變化的角度探討β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的影響，為β-葡聚糖抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7巨噬細(xì)胞（來(lái)自小鼠）由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院提供；用1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，胰酶消化傳代。培養(yǎng)液中加入β-葡聚糖（0，2.5，5，10 μg/mL）干預(yù)24 h，加入20 μL MTT孵育4 h后，加入DMSO 120 μL震蕩10 min，在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)吸光度A570。

1.2 油紅O染色

將RAW 264.7細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，隨機(jī)分為對(duì)照組、oxLDL處理組 （80 μg/mL oxLDL孵育細(xì)胞24 h）、β-葡聚糖處理組 (5 μg/mL β-葡聚糖及80 μg/mL oxLDL共同孵育細(xì)胞24 h)。細(xì)胞孵育結(jié)束后，吸棄上清液，10%多聚甲醛固定30 min，PBS輕輕洗1次后，油紅O染色10 min，再用60%異丙醇洗細(xì)胞1次（孵育時(shí)間10 s），吸棄異丙醇，PBS輕輕洗1次后顯微鏡下照相。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

油紅O、甘油明膠、β-葡聚糖購(gòu)自sigma公司；SR-A、CD36、c-Jun、c-fos、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；1640培養(yǎng)基、消化胰酶、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；oxLDL購(gòu)自廣州奕源生物公司。

1.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。25 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合后煮沸 10 min，SDS-PAGE電泳100V恒壓2 h，濕轉(zhuǎn)500 mA恒流1.5 h，5%脫脂奶粉封膜1 h，PBST漂洗3次后分別加入一抗和β-actin 4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，37℃二抗（1∶1 000稀釋?zhuān)┓磻?yīng)1 h后進(jìn)行ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 β-葡聚糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

不同濃度的β-葡聚糖（0、2.5、5、10 μg/mL）孵育巨噬細(xì)胞24 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)所得A570值分別為3.65±0.05、3.68±0.06、3.68 ±0.061、3.69±0.069，β-葡聚糖處理組與對(duì)照組（0 μg/mL β-葡聚糖）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果如圖1所示，2.5～10 μg/mL的β-葡聚糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活性無(wú)影響，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取的β-葡聚糖濃度為2.5～10 μg/mL。

圖1 β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

2.2 β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性的泡沫細(xì)胞形成的影響

由圖2可知，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)聚集的脂質(zhì)較少，oxLDL處理組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增多，油紅O染色后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的（5±0.07）倍，與oxLDL組比較，β-葡聚糖（5 μg/mL）處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集減少，油紅O染色后陽(yáng)性細(xì)胞減少（90±1.8）%。圖2的結(jié)果表明β-葡聚糖可以抑制巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL攝取，從而減少泡沫細(xì)胞的形成。

2.3 β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜蛋白SR-A、CD36蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，β-葡聚糖劑量依耐性的減少巨噬細(xì)胞SR-A蛋白的表達(dá)，不同濃度（2.5、5、10 μg/mL）的β-葡聚糖處理巨噬細(xì)胞后，SR-A蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.6±0.02、0.56±0.04、0.3±0.031倍，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但β-葡聚糖對(duì)CD36蛋白的表達(dá)無(wú)影響，（2.5、5、10 μg/mL）β-葡聚糖處理巨噬細(xì)胞后，CD36蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.99±0.04、0.986±0.08、0.98± 0.07倍，β-葡聚糖處理組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明β-葡聚糖可能通過(guò)抑制SR-A蛋白表達(dá)，從而抑制巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取。

圖2 β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性的泡沫細(xì)胞形成的影響（油紅O染色×400）

圖3 β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞CD36、SR-A蛋白表達(dá)的影響

圖4 β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞核c-fos、c-Jun蛋白量的影響

2.4 β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞核c-Jun、c-fos蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，β-葡聚糖劑量依耐性的減少細(xì)胞核c-Jun蛋白量，（2.5、5、10 μg/mL）β-葡聚糖處理巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞核c-Jun蛋白量降低為對(duì)照組的0.5±0.03、0.4±0.04、0.3±0.07倍，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但對(duì)細(xì)胞核c-fos蛋白量無(wú)影響，（2.5、5、10 μg/mL）β-葡聚糖處理巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞核c-fos蛋白量降低為對(duì)照組的0.97± 0.06、0.98±0.08、0.96±0.05倍，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 c-Jun N端激酶抑制劑SP600125對(duì)β-葡聚糖減少巨噬細(xì)胞SR-A蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，c-Jun N端激酶抑制劑SP600125（10 μM）進(jìn)一步增加β-葡聚糖（5 μg/mL）減少巨噬細(xì)胞SR-A蛋白表達(dá)的作用。β-葡聚糖（5 μg/mL）處理細(xì)胞后，SR-A蛋白量降低為對(duì)照組的0.56±0.04倍，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；SP600125與β-葡聚糖共同孵育巨噬細(xì)胞后，SR-A蛋白量降低為對(duì)照組的0.24±0.05倍，與β-葡聚糖處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)合圖4及圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示β-葡聚糖可能通過(guò)抑制c-Jun/SR-A通路減少巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取。

圖5 SP600125對(duì)β-葡聚糖減少巨噬細(xì)胞SR-A蛋白表達(dá)的影響

3 討論

已有研究表明β-葡聚糖有降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5]。但β-葡聚糖是否減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集及相關(guān)機(jī)制尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示，β-葡聚糖通過(guò)減少巨噬細(xì)胞清道夫受體SR-A的表達(dá)，減少了巨噬細(xì)胞攝取oxLDL，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。

清道夫受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集在泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中起著重要的作用[2]。本研究結(jié)果首次證明β-葡聚糖通過(guò)減少巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取，從而抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。此外，β-葡聚糖顯著降低巨噬細(xì)胞SR-A蛋白的表達(dá)，但是對(duì)CD36蛋白的表達(dá)無(wú)影響。清道夫受體CD36和SR-A是巨噬細(xì)胞攝取oxLDL的主要受體[3]。研究表明，與對(duì)照組比較，SR-A轉(zhuǎn)基因后促進(jìn)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展以及泡沫細(xì)胞在血管壁的聚集[6]。此外，巨噬細(xì)胞SR-A蛋白的表達(dá)受抗氧化物及細(xì)胞因子的調(diào)控，表明SR-A與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)[7-9]。本研究表明，β-葡聚糖通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞SR-A蛋白的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取與β-葡聚糖減少巨噬細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)有關(guān)。結(jié)果顯示，c-Jun N-端激酶抑制劑SP600125增加了β-葡聚糖對(duì)SR-A蛋白表達(dá)的抑制作用。由此表明，β-葡聚糖抑制泡沫細(xì)胞形成需要抑制c-Jun通路。

總之，本研究結(jié)果表明，β-葡聚糖通過(guò)降低巨噬細(xì)胞細(xì)胞核c-Jun蛋白的表達(dá)，減少清道夫受體SR-A蛋白的表達(dá)，從而減少巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取，最終抑制泡沫細(xì)胞的形成。該研究結(jié)果為β-葡聚糖抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.Sung HJ,Kim J,Kim Y,et al.N-acetyl cysteine suppresses the foam cell formation that is induced by oxidized low density lipoprotein via regulation of gene expression [J].Mol Biol Rep,2012,39（3）:3001-7.

2.Tsai JY,Su KH,Shyue SK,et al.EGb761 ameliorates the formation of foam cells by regulating the expression of SR-A and ABCA1:role of haem oxygenase-1[J].Cardiovasc Res,2010,88（3）:415-23.

3.Lin CY,Lee TS,Chen CC,et al.Endothelin-1 exacerbates lipid accumulation by increasing the protein degradation of the ATP-binding cassette transporter G1 in macrophages[J].J Cell Physiol,2011,226（8）:2198-205.

4.Li XY,Kong LX,Li J,et al.Kaempferol suppresses lipid accumulation in macrophages through the downregulation of cluster of differentiation 36 and the upregulation of scavenger receptor class B type I and ATP-binding cassette transporters A1 and G1[J].Int J Mol Med，2013，31（2）:331-8.

5.申瑞玲，朱瑩瑩，李林，等.燕麥β-葡聚糖調(diào)節(jié)腸道菌群與降脂減肥作用的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2014, 35（8）：364-366.

6.Van Eck M,De Winther MP,Herijgers N,et al.Effect of human scavenger receptor class A overexpression in bone marrow-derived cells on cholesterol levels and atherosclerosis in ApoE-deficient mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20（12）:2600-6.

7.Takeda N,Manabe I,Shindo T,et al.Synthetic retinoid Am80 reduces scavenger receptor expression and atherosclerosis in mice by inhibiting IL-6[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26（5）:1177-83.

8.Napolitano M,De Pascale C,Wheeler-Jones C,et al.Effects of lycopene on the induction of foam cell formation by modified LDL[J].Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007,293（6）:E1820-7.

9.Józefowski S,Arredouani M,Sulahian T,et al.Disparate regulation and function of the class A scavenger receptors SR-AI/II and MARCO[J].J Immunol,2005,175（12）:8032-41.

（2016-01-20收稿）

Effects of茁-glucan on the uptake of oxLDL in macrophages

Li Xiuying,Ye yun
Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan Province，China

Objective：To explore the effects and the mechanisms of β-glucan on the formation of macrophage-derived foam cells.Methods：The effects of β-glucan on cell viability was examined by MTT.Oil-red O staining was used to observe the effects of β-glucan on the uptake of oxLDL，and the effects of β-glucan on SRA、CD36、c-fos、c-Jun protein expression in macrophages were investigated using Western blot.Data were analyzed using SPSS 10.0 statistical software and two-tailed t test was used for statistical significance assessment.Results:β-glucan ranged from 2.5～10 μg/mL did not affect cell viability，and at 5 μg/mL inhibited the formation of macrophage-derived foam cells via attenuating oxLDL uptake by macrophages.Compared with control group,β-glucan (2.5～10 μg/mL)treatment dose-dependently decreased the expression of SR-A and nuclear c-Jun without affecting that of CD36 and nuclear c-fos in macrophages.Compared with β-glucan at 5 μg/mL group,SP600125(c-Jun inhibitor)significantly augmented the inhibitory effects of β-glucan on SR-A expression(P＜0.05).Conclusion：β-glucan could inhibit the formation of macrophage-derived foam cells,which are possibly related to the inactivation of c-Jun/SR-A pathway.

Athrosclerosis;Cell model;β-glucan;Macrophage;Foam cells

R645

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.002

*國(guó)家青年自然科學(xué)基金（81500357）

李秀英(1987-)，女，博士。

葉 云(1963-)，男，教授。E-mail:yeyun8622@163.com