胡 俊，袁常珍，廖 晴，李翅翔,茍鵬英

（瀘州市食品藥品檢驗所中藥室，四川瀘州 646000）

高效液相色譜法測定氨咖黃敏膠囊中對乙酰氨基酚含量

胡 俊，袁常珍，廖 晴，李翅翔,茍鵬英

（瀘州市食品藥品檢驗所中藥室，四川瀘州 646000）

目的:采用高效液相色譜法測定氨咖黃敏膠囊中對乙酰氨基酚的含量。方法:采用Hypersil ODS2（4.6 mm×200 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（20∶80∶0.02）（用磷酸調(diào)pH為3.2）為流動相，流速1 mL/min；檢測波長243 nm；柱溫30℃。結(jié)果:對乙酰氨基酚濃度在18.09～90.43 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，平均加樣回收率為101.7%，RSD為0.58%。結(jié)論:此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于測定氨咖黃敏膠囊中對乙酰氨基酚含量。

高效液相色譜法；氨咖黃敏膠囊；對乙酰氨基酚

對乙酰氨基酚是常用解熱鎮(zhèn)痛藥，過去一直認(rèn)為該藥是安全有效的。但近年來美國食品藥品管理局（FDA）多次報道服用過量的對乙酰氨基酚可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，甚至死亡[1]。因此準(zhǔn)確控制高含量制劑中對乙酰氨基酚含量顯得極為必要。氨咖黃敏膠囊是由對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、人工牛黃、咖啡因組成的復(fù)方制劑，其中對乙酰氨基酚的標(biāo)示含量高達(dá)250 mg。因其能快速有效的緩解普通感冒和流行性感冒引起的發(fā)熱、頭痛、四肢酸痛等臨床癥狀，成為深受患者青睞的常用非處方感冒藥。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-（HD-0276）-2002-2006。該標(biāo)準(zhǔn)采用容量分析法測定復(fù)方制劑中對乙酰氨基酚的含量，其前處理需要加稀鹽酸加熱回流，操作較為繁瑣。滴定終點判定需用細(xì)玻璃棒蘸取溶液少許，劃過涂有含鋅碘化鉀淀粉指示液的白瓷板上，觀察條痕的顏色變化。這種終點判定的方法很不直觀方便，既會因蘸取溶液而使成分損失又容易出現(xiàn)滴過終點的情況。亞硝酸鈉滴定法的專屬性也不高，應(yīng)用于復(fù)方制劑的分析很容易受到其他藥物成分和輔料成分的干擾。因此該含量測定方法的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度和可操作性都有待進一步提高。鑒于此，筆者在查閱大量資料的基礎(chǔ)上做了大量的摸索實驗，最終選用專屬性高的高效液相色譜法測定該復(fù)方制劑中對乙酰氨基酚的含量，取得了滿意的效果，為該制劑質(zhì)量檢驗提供了準(zhǔn)確可靠的檢測分析方法。

1 儀器與方法

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機、柱溫箱、二極管陣列檢測器、自動進樣器、色譜工作站 （美國安捷倫科技有限公司）；XS205DU十萬分之一電子分析天平 （瑞士Mettler Toledo）；Seven Excellence型酸度計 （瑞士 Mettler Toledo）；101A-1BY電熱恒溫干燥箱（上?？德穬x器設(shè)備有限公司）；KH7200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）。

1.2 材料與試藥

三批氨咖黃敏膠囊（山西好醫(yī)生藥業(yè)有限公司，批號150 101，重慶迪康長江制藥有限公司，批號151 101，重慶申高生化制藥股份有限公司，批號151 202）；對乙酰氨基酚對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，編號100 018-201 409，純度99.9%；咖啡因?qū)φ掌酚芍袊称匪幤窓z定研究院提供，編號171 215-201 211，純度99.9%；馬來酸氯苯那敏對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，編號100 047-201 507；人工牛黃對照藥材由中國食品藥品檢定研究院提供，編號121 197-200 903；甲醇（進口色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：伊利特Hypersil ODS2（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（20∶80∶0.02）（用磷酸調(diào)pH為3.2）；流速：1 mL/min；檢測波長243 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL（所有樣品進樣前過0.45 μm的濾膜）。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥2 h的對乙酰氨基酚對照品適量，加25%甲醇溶液溶解并稀釋成每1 mL含對乙酰氨基酚0.028 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

取氨咖黃敏膠囊10粒的內(nèi)容物混勻精密稱取適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚0.07 g）置100 mL量瓶中，加25%甲醇溶液適量，超聲振蕩處理30 min，放冷，用25%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL置50 mL量瓶中，加25%甲醇溶液至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2 結(jié) 果

2.1 方法驗證

2.1.1 系統(tǒng)適用性試驗

取供試品溶液和對照品溶液按“1.3.1”色譜條件下方法進樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明理論塔板數(shù)按對乙酰氨基酚峰計算不低于11 000，對乙酰氨基酚峰與相鄰峰分離度均大于4。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗HPLC色譜圖

2.1.2 專屬性試驗

取咖啡因、馬來酸氯苯那敏和人工牛黃按氨咖黃敏膠囊處方比例制成缺對乙酰氨基酚陰性樣品，照1.3.2.2供試品溶液制備方法制成缺對乙酰氨基酚陰性對照溶液，按“1.3.1”色譜條件下方法進樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明在對乙酰氨基酚保留時間處無干擾色譜峰，本方法的專屬性良好。

圖2 專屬性試驗HPLC色譜圖

2.1.3 線性關(guān)系考察

精密稱取105℃干燥2 h的對乙酰氨基酚對照品45.26 mg，置100 mL量瓶中，用25%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL置50 mL量瓶中，加25%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，得到各濃度的峰面積值，結(jié)果見表1。以色譜峰面積值為縱坐標(biāo)Y，以對乙酰氨基酚濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程Y=32.5907X+0.7313，r=0.9999。結(jié)果表明對乙酰氨基酚濃度在18.09～90.43 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

表1 對乙酰氨基酚濃度與對應(yīng)的色譜峰面積值

2.1.4 精密度試驗

將同一對照品溶液，在相同的色譜條件下連續(xù)進樣6次，每次10 μL，6次峰面積值見表2，RSD為0.53%，表明對乙酰氨基酚進樣的精密度良好。

表2 6次進樣的峰面積值

2.1.5 穩(wěn)定性試驗

將同一供試品溶液在室溫下分別放置0、2、4、8、12和24 h后進樣，峰面積的RSD為0.61%，表明24 h內(nèi)對乙酰氨基酚穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗

取同一生產(chǎn)批號（山西好醫(yī)生藥業(yè)有限公司，批號150 101）的樣品，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件進行6份平行測定，6份含量測定結(jié)果見表3，RSD為0.59%，表明本法測定的重復(fù)性良好。

表3 6份含量測定結(jié)果

2.1.7 加樣回收率試驗

照1.3.2.2供試品溶液的制備方法，精密稱取已知含量的同一生產(chǎn)批號（山西好醫(yī)生藥業(yè)有限公司，批號150 101）的樣品6份，精密加入濃度為0.5237 mg/mL的對照品溶液20 mL，制成供試品加標(biāo)溶液進樣分析，計算回收率，結(jié)果見表4，平均回收率為101.7%，RSD為1.3%，回收率符合有關(guān)規(guī)定。

表4 6份回收率

2.2 樣品測定

取批號為150 101、151 101、151 202的三批氨咖黃敏膠囊分別制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件下方法進樣分析，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計算，測得對乙酰氨基酚含量分別為標(biāo)示量的99.7%、99.3%、99.5%。三批樣品用容量分析法測得結(jié)果分別為99.4%、98.9%、99.2%，相對偏差分別為0.15%、0.20%、0.15%。

3 討論

3.1 檢測方法類型的比較與選擇

文獻(xiàn)報道對乙酰氨基酚的常用含量測定方法有亞硝酸鈉滴定分析法[2]、紫外分光光度法和高效液相色譜法[3]。亞硝酸鈉滴定分析法存在缺陷，其前處理繁瑣、復(fù)雜，外指示劑的使用進一步增加了操作環(huán)節(jié)，而且使得顯色不夠明顯，終點不易掌握，人為的差異很大，需要經(jīng)驗，例如若溶液蘸取次數(shù)過多，容易造成損失，使結(jié)果判斷不準(zhǔn)確。通過對2.2樣品測定結(jié)果進行對比分析，發(fā)現(xiàn)三批樣品的亞硝酸鈉滴定分析法測得數(shù)據(jù)均小于高效液相色譜法測得數(shù)據(jù)，這一結(jié)果正好應(yīng)證了滴定分析法中蘸取溶液的確會造成損失導(dǎo)致測定結(jié)果偏小。亞硝酸鈉滴定法的專屬性也不高，應(yīng)用于復(fù)方制劑的分析很容易受到其他藥物成分和輔料成分的干擾[4]。紫外分光光度法的專屬性同樣不高，用于復(fù)方制劑的含量測定同樣會受到其它藥物成分和輔料成分的干擾。因此本品作為復(fù)方制劑適宜選用專屬性高、操作方便的高效液相色譜法進行含量測定。

3.2 流動相的選擇

通過對流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺（20∶80∶0.02）（用磷酸調(diào)pH為3.2）、甲醇-水-磷酸（22∶78∶0.1）[3]、甲醇-0.5%冰醋酸溶液（20:80）[5]和0.05 mol/L醋酸銨溶液-甲醇（85∶15）[6]進行實驗比較，結(jié)果甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺 （20∶80∶0.02）（用磷酸調(diào)pH為3.2）系統(tǒng)分離效果和拖尾因子良好，保留時間適度，故選擇本系統(tǒng)為流動相。

3.3 檢測波長的確定

通過二極管陣列檢測器對對照品溶液在200～400 nm進行掃描，結(jié)果在243 nm處有最大吸收，故選擇243 nm作為檢測波長。

3.4 溶解溶劑的選擇

文獻(xiàn)報道溶解對乙酰氨基酚的溶劑有25%甲醇溶液、水、氫氧化鈉溶液。經(jīng)實驗比較對乙酰氨基酚在25%甲醇溶液中溶解性良好，在溶液中成分的結(jié)構(gòu)形態(tài)穩(wěn)定且該溶液與流動相的匹配性良好，故選擇25%甲醇溶液作為溶解溶劑。

3.5 供試品溶液制備提取方式的選擇

供試品提取方式有振搖、加熱回流和超聲振蕩三種常用方式。加熱回流操作較繁瑣且會使被測成分對乙酰氨基酚不穩(wěn)定；振搖溶解速度較慢且占用人工效率低下；超聲振蕩不僅操作方便快捷而且還有被測成分穩(wěn)定的優(yōu)點。所以選擇超聲振蕩提取制備供試品溶液。

3.6 供試品溶液制備提取時間的確定

試驗發(fā)現(xiàn)超聲振蕩15～60 min試驗結(jié)果基本一致，為確保對乙酰氨基酚充分溶解選擇超聲振蕩30 min。

3.7 小結(jié)

實驗結(jié)果顯示用本方法測定對乙酰氨基酚含量，樣品預(yù)處理簡單，系統(tǒng)適用性優(yōu)良，陰性對照無干擾專屬性強，線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度均良好，更適用于對乙酰氨基酚的含量控制。

1.司繼剛,趙群,曹原.對乙酰氨基酚肝毒性評價分析[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（19）：3537-3538.

2.王玉.藥品檢驗指南（上冊）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011：293-294.

3.國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].第二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：234-238.

4.王慧文,張士洋.氨咖黃敏膠囊中對乙酰氨基酚含量3種測定方法的比較[J].安徽醫(yī)藥，2005，9（5）：354-356.

5.國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].第二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1141.

6.董超琪.HPLC法測定對乙酰氨基酚滴劑的含量[J].海峽藥學(xué)，2014，26（5）：52-53.

（2016-01-20收稿）

Determination of paracetamol in Ankahuangmin capsule by HPLC

Hu Jun,Yuan Changzhen,Liao Qing,Li Chixiang,Gou Pengying
TCM chanber of Food and Drug Inspertion,Luzhou 646000,Sichuan Province,China

Objective：To determine the content of paracetamol in Ankahuangmin capsule by HPLC.Methods：Hypersil ODS2 （4.6 mm×200 mm,5 μm）column,and the moving phase of methanol-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution-triethylamine （20∶80∶0.02，pH 3.2 adjusted with phosphoric acid）were used in the experiment.The flow rate was 1 mL/min,detection wavelength 243 nm,and column temperature was 30℃.Results:Paracetamol concentration in the range of 18.09～90.43 μg/mL and the peak area was linear relationship,r=0.9999,the average recovery was 101.7%,RSD was 0.58%.Conclusion：This method is simple, accurate,reproducible,and can be used to determine the content of paracetamol in Ankahuangmin capsule.

HPLC;Ankahuangmin capsule;Paracetamol

R917

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.013

胡 ?。?974-），男，主管藥師。E-mail:1048225901@qq.com