洪鈺杰，鐘國強(qiáng)，蔣智淵，方曙，孫培震

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內(nèi)皮素-1在心房顫動(dòng)發(fā)生中的機(jī)制探討

洪鈺杰，鐘國強(qiáng)，蔣智淵，方曙，孫培震

摘要

關(guān)鍵詞心房顫動(dòng)；內(nèi)皮素-1；心房纖維化

作者單位：530021 廣西省南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科

Effect of Endothelin-1 on Atrial Fibrosis in Patients With Atrial Fibrillation

HONG Yu-jie, ZHONG Guo-qiang, JIANG Zhi-yuan, FANG Shu, SUN Pei-zhen.
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning (530021), Guangxi, China
Corresponding Author: ZHONG Guo-qiang, Email: gq_zhong@126.com

Abstract

Objective: To explore the effect of endothelin-1 on atrial fibrosis in patients with atrial fibrillation (AF).

Methods: A total of 72 patients with thoracotomy were studied, the patients were divided into 2 groups: AF group, n=39 and Sinus rhythm (SR) group, n=33.The mRNA and protein expressions of endothelin-1 (ET-1), platelet derived growth factor-B (PDGF-B) and collagen I (COL1) in right atrial appendage (RAA) tissue were measured by RT-PCR and Western blot analysis; meanwhile, the impact of ET-1 stimulation and non-selective ET-1 receptor antagonist (sulfafurazole SIZ) on PDGF-B mRNA and protein expressions in H9c2 cells were measured.

Results: ①The RAA tissue mRNA and protein expressions in AF group were higher than those in SR group, as for ET-1 (2.830 ± 2.276) vs (1.220 ± 0.887) and (0.835 ± 0.241) vs (0.286 ± 0.083), both P<0.01; for PDGF-B (2.568 ± 2.348) vs (1.567 ± 0.831) and (0.807±0.241) vs (0.381 ± 0.105), both P<0.05; for COL1 α1 (3.376 ± 1.598) vs (1.629 ± 0.833) and (0.652 ± 0.210) vs (0.312 ± 0.12), both P<0.05.②The protein expressions of ET-1 and COL1 had positive correlation (r=0.580, P<0.01).③ET-1 promoted PDGF-B secretion in H9c2 cells in a concentration and time-dependent manner; SIZ could reduce such promotion.

Conclusion: ET-1 plays an important role in AF occurrence which might be related to PDGF-B regulation.

Key words Atrial fibrillation; Endothelin-1; Atrial fibrosis

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:146.)

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床上最常見的心律失常，致殘、致死率高。房顫發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，心房重構(gòu)是其中心環(huán)節(jié)。心房纖維化作為心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)最顯著的特征，與房顫的發(fā)生密切相關(guān)[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者心房組織和外周血內(nèi)皮素-1（ET-1）表達(dá)升高[2-5]，但ET-1在房顫發(fā)病中的具體作用，目前尚不清楚。已有的研究表明，ET-1與心肌纖維化密切相關(guān)[6]，并且ET-1對血小板衍生生長因子（PDGF）具有調(diào)控作用[7]。PDGF-B是重要的致心房纖維化因子[8]，ET-1是否通過調(diào)控PDGF-B促進(jìn)心房纖維化而參與房顫的發(fā)生？目前尚少見報(bào)道。本研究旨在初步探討ET-1在房顫發(fā)生中的作用和可能的作用機(jī)制。

1　資料與方法

對象：選擇2012-10至2014-06我院心臟外科住院的72例心臟外科手術(shù)患者為研究對象，分為房顫組（39例）和竇性心律（竇律）組（33例）。其中，心臟瓣膜病患者61例，房間隔缺損患者6例，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者5例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并感染性心內(nèi)膜炎；（2）合并風(fēng)濕活動(dòng)征象；（3）高血壓；（4）內(nèi)分泌紊亂、甲狀腺功能亢進(jìn)；（5）自身免疫性疾??；（6）嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤；（7）年齡＜18歲；（8）心臟二次手術(shù)者。本研究所有入選患者簽署書面知情同意書，并獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

兩組患者性別、年齡、基礎(chǔ)心臟疾?。ǔ饴?lián)合瓣膜病變）、紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）心功能等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但房顫組患者左心房內(nèi)徑明顯大于竇律組（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（表1）

右心耳標(biāo)本獲?。河诮Ⅲw外循環(huán)插腔靜脈管前，切開右心耳時(shí)切取約150 mg右心耳組織，部分放入液氮中凍存，部分用4%多聚甲醛固定。

細(xì)胞培養(yǎng)：H9c2細(xì)胞系（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫）在含有10% 胎牛血清（Gibco），2 mM 谷氨酰胺，100 U/ ml 青霉素和100 μg/ ml鏈霉素的HG-DMEM 培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁和生長情況，待細(xì)胞約80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的細(xì)胞傳代，按1:2分瓶接種，每隔48～72 h更換培養(yǎng)基1次。

ET-1干預(yù)H9c2細(xì)胞：ET-1（PROSPEC）干預(yù)前H9c2細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基同步化24 h。H9c2細(xì)胞在含ET-1（0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L）培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24 h；此后，H9c2細(xì)胞在含ET-1 10 nmol/L培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h 、72 h；最后，H9c2細(xì)胞在含ET-1 10 nmol/L+ SIZ[9]（Sigma，美國）2 mmol/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

表1　兩組患者一般臨床資料的比較[例（%）]

右心耳組織馬松（Masson）染色：右心耳組織固定后石蠟包埋，制成5 μm石蠟切片，脫蠟、梯度酒精脫水處理，蘇木素—伊紅染色10 min，Masson復(fù)合染液染色5 min，0.2%磷酸鎢酸處理切片5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次。亮綠染色5 min，常規(guī)無水乙醇脫水、透明及封固，光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：（1）組織及細(xì)胞總RNA提?。?Trizol（Invitrogen）提取組織和細(xì)胞總RNA，NanoDrop2000型微量分光光度計(jì)測定RNA的OD280/OD260值（1.8～2.0）；（2）cDNA合成：按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （TAKARA）試劑盒說明書操作，進(jìn)行總RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；（3）引物設(shè)計(jì)與合成：人ET-1、PDGF-B、I型膠原α1亞基（COL1α1）和內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物，大鼠PDGF-B和內(nèi)參照GAPDH引物由日本TAKARA公司設(shè)計(jì)合成（表2）；（4）熒光定量PCR: 按SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TAKARA）說明書操作，使用ABI 7300熒光定量PCR儀檢測人ET-1、PDGF-B、COL1α1，大鼠PDGF-B mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果以2-△△CT表示。

表2　基因引物序列

蛋白免疫印跡（Western blot）檢測：提取右心耳組織和細(xì)胞總蛋白，各蛋白樣孔蛋白上樣總量30 μg；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；濕法轉(zhuǎn)膜；孵育一抗（4℃過夜）：抗ET-1鼠單克隆抗體 (Abcam） 1:500、抗PDGF-B兔單克隆抗體(Abcam） 1：1 000、抗COL1鼠單克隆抗體(Abcam） 1：500、抗GAPDH鼠單克隆抗體（Sigma）1：10 000；孵育二抗（常溫1～2 h）：熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體（Licor） 1:10 000、熒光標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（Rockland）1:10 000；Odyssey熒光成像系統(tǒng)掃膜，以GAPDH為內(nèi)參照，檢測人ET-1、PDGF-B、COL1及大鼠PDGF-B蛋白相對表達(dá)，結(jié)果以目的蛋白條帶與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值表示。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示；兩組間計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；多組間總體均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)兩兩比較，采用q檢驗(yàn)；單因素相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組患者右心耳ET-1表達(dá)

房顫組患者右心耳ET-1 mRNA表達(dá)水平（2.830±2.276）明顯高于竇律組（1.220 ±0.887）（t=4.068，P<0.01）；蛋白表達(dá)水平（0.835±0.241）亦明顯高于竇律組（0.286±0.083）（t=-13.309， P<0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖1A）

2.2兩組患者右心耳PDGF-B表達(dá)

房顫組患者右心耳PDGF-B mRNA表達(dá)水平（2.568±2.348）明顯高于竇律組（1.567 ±0.831）（t=2.482，P<0.05）；蛋白表達(dá)水平（0.807±0.241）亦明顯高于竇律組（0.381±0.105）（t=-10.860，P<0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖1B）

2.3兩組患者右心耳COL1表達(dá)

房顫組患者右心耳COL1α1 mRNA表達(dá)水平（3.376±1.598）明顯高于竇律組（1.629±0.833）（t=5.941，P<0.05）；COL1蛋白表達(dá)水平（0.652±0.210）亦明顯高于竇律組（0.312±0.122） （t=-8.565，P<0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖1C）

注：AF：房顫組；SR：竇律組；ET-1：內(nèi)皮素-1；PDGF-B：血小板衍生生長因子-B；COL1：I型膠原；GAPDH: 磷酸甘油醛脫氫酶

2.4ET-1與COL1相關(guān)性分析

單因素相關(guān)分析顯示兩組患者右心耳COL1蛋白表達(dá)水平與ET-1蛋白表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)（r=0.580，P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5兩組患者右心耳膠原纖維沉積

Masson染色提示房顫組患者右心耳膠原纖維沉積明顯多于竇律組患者，呈粗大的束狀包裹、分隔心肌纖維。（圖2）

圖2　兩組患者右心耳膠原纖維沉積

2.6ET-1對H9c2細(xì)胞PDGF-B分泌的影響

（1）不同濃度ET-1對H9c2細(xì)胞PDGF-B mRNA表達(dá)的影響：與0 nmol/L（1.043±0.102）比較，1 nmol/L ET-1（1.314±0.131，q=6.335，P<0.01）、10 nmol/L ET-1（1.671±0.131，q=14.687，P<0.01）、100 nmol/L ET-1（1.973±0.145，q=21.737，P<0.01）、H9c2細(xì)胞PDGF-B mRNA表達(dá)水平明顯升高，且1 nmol/L、10 nmol/L (q=8.352，P<0.01）、100 nmol/L (q=7.050，P<0.01） PDGF-B mRNA表達(dá)水平進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（2）不同濃度ET-1對H9c2細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)的影響：與0 nmol/L（0.070±0.028）比較，1 nmol/L ET-1（0.163±0.025，q=7.111，P<0.01）、10 nmol/L ET-1（0.355±0.043，q=21.792，P<0.01）、100 nmol/L ET-1（0.623±0.053，q=42.267，P<0.01）H9c2細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)水平明顯升高，且1 nmol/L、10 nmol/L (q=14.681，P<0.01）、100 nmol/ L（q=20.475，P<0.01）PDGF-B蛋白表達(dá)水平進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(圖3）

圖3　不同濃度ET-1對H9c2細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)的影響

（3）ET-1培養(yǎng)不同時(shí)間對H9c2細(xì)胞PDGF-B mRNA表達(dá)的影響：與0 h（0.966±0.131）比較，24 h（1.671±0.131，q=13.151，P<0.01）、48 h（1.999±0.178，q=19.277，P<0.01）、72 h （2.278±0.194，q=24.462，P<0.01）H9c2細(xì)胞PDGF-B mRNA表達(dá)水平明顯升高，且24 h、48 h （q=6.126，P<0.01）、72 h（q=5.185，P<0.01）PDGF-B mRNA表達(dá)水平進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（4）ET-1培養(yǎng)不同時(shí)間對H9c2細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)的影響：與0 h（0.069±0.019）比較，24 h（0.355±0.043，q=23.428，P<0.01）、48 h （0 .6 2 8±0 .0 3 8，q = 4 5 .7 6 9，P< 0 .0 1）、72 h（0.750±0.041，q=55.721，P<0.01） H9c2細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)水平明顯升高，且24 h、48 h（q=22.341，P<0.01）、72 h（q=9.952，P<0.01）PDGF-B蛋白表達(dá)水平進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖4）

圖4　ET-1培養(yǎng)不同時(shí)間對H9c2細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)的影響

（5）內(nèi)皮素拮抗劑對ET-1培養(yǎng)下H9c2細(xì)胞PDGF-B表達(dá)的影響：與10 nmol/L ET-1比較，ET-1 10 nmol/L+ SIZ 2 mmol/L的H9c2細(xì)胞PDGF-B mRNA表達(dá)水平（1.426±0.130）明顯下降（t=3.633，P<0.01）；PDGF-B蛋白水平（0.246±0.022）也明顯下降（t=6.510，P<0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖3）

3　討論

內(nèi)皮素是一種由21個(gè)氨基酸殘基組成的活性多肽，主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等也有一定表達(dá)。ET-1是人體最主要的內(nèi)皮素，它促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌樣成纖維細(xì)胞分化，增加細(xì)胞外基質(zhì)合成，是導(dǎo)致心肌纖維化的重要因素[6，10-12]。

近來，ET-1在房顫發(fā)病中的作用越來越受重視。Zakeri 等[3]研究表明，與單純的心力衰竭患者相比，合并房顫者血漿ET-1表達(dá)更高。Abed等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著山羊體重的增加，其心房ET-1及內(nèi)皮素受體ETA和ETB表達(dá)增加，房顫發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高。Mayyas等[14]發(fā)現(xiàn)通過飲食補(bǔ)充ω3不飽和脂肪酸可以減少實(shí)驗(yàn)犬心臟術(shù)后房顫的發(fā)生，并且降低血漿ET-1表達(dá)。Nakazawa等[15]發(fā)現(xiàn)術(shù)前血漿ET-1表達(dá)水平是預(yù)測環(huán)肺靜脈消融術(shù)后3～6個(gè)月復(fù)發(fā)率的重要指標(biāo)。Latini等[16]也發(fā)現(xiàn)，房顫時(shí)血漿ET-1前體肽增加，是預(yù)測房顫復(fù)發(fā)的良好指標(biāo)。上述研究的共同特點(diǎn)在于，房顫時(shí)血漿或是心房ET-1表達(dá)明顯升高，可見ET-1過度表達(dá)在房顫發(fā)病中起著重要作用。遺憾的是，上述研究均未對ET-1在房顫發(fā)病中的具體作用進(jìn)行深入的研究。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，房顫組患者右心耳ET-1、COL1表達(dá)以及膠原纖維沉積均明顯高于竇律組，且兩組患者右心耳COL1表達(dá)水平與ET-1表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)，提示ET-1可能通過促進(jìn)心房纖維化而參與房顫的發(fā)生。Mayyas等[4]研究結(jié)果與我們的研究相似，他們發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性心臟病患者左心耳ET-1表達(dá)水平與左心房大小、心房纖維化程度以及房顫的發(fā)生有明顯的相關(guān)性。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，ET-1可以促進(jìn)H9c2細(xì)胞PDGF-B mRNA和蛋白的合成，并且表現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性。SIZ可以減弱ET-1對H9c2細(xì)胞PDGF-B合成的促進(jìn)作用。上述結(jié)果表明ET-1可在基因轉(zhuǎn)錄水平對PDGF-B信號通路進(jìn)行調(diào)控。

PDGF是多種間充質(zhì)來源細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等）的主要絲裂原，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞生長、遷移、增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在組織損傷后修復(fù)中起著重要作用。但病理狀態(tài)下，過度激活的PDGF可使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌樣成纖維細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致心房纖維化，促進(jìn)房顫的發(fā)生[8]。PDGF主要以旁分泌的形式作用于其效應(yīng)細(xì)胞，其受體（PDGFR）在成纖維細(xì)胞高度表達(dá)[17]，因此心房成纖維細(xì)胞是PDGF最主要的效應(yīng)細(xì)胞之一。據(jù)此我們推測，ET-1可能通過刺激心房肌細(xì)胞合成PDGF-B，并以旁分泌的形式作用于心房成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致心房纖維化和房顫的發(fā)生。

我們的研究表明，ET-1可能通過上調(diào)PDGF-B促進(jìn)心房纖維化而參與房顫的發(fā)生，有望為房顫的干預(yù)提供新的靶點(diǎn)。但目前只是體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，有待于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。另一方面，由于病例數(shù)有限，研究中大部分為心臟瓣膜病患者，僅有少部分為非心臟瓣膜病患者，ET-1在非瓣膜病性房顫中的作用是否如此，仍有待考證。進(jìn)一步收集病例，探討ET-1在不同基礎(chǔ)心臟疾病房顫發(fā)生中的作用，將更加有利于問題的闡明。此外，ET-1促進(jìn)心肌細(xì)胞PDGF-B分泌的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索，我們將在今后的研究中逐步完善。

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（編輯：漆利萍）

收稿日期：（2015-05-20）

中圖分類號：R54

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）02-0146-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.02.011

作者簡介：洪鈺杰 碩士研究生 主要從事心律失常的基礎(chǔ)與臨床研究 Email：15077177145@163.com 通訊作者：鐘國強(qiáng)Email：gq_zhong@126.com

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013GXNSFAA019167) ；國家自然科學(xué)基金課題地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(81460057)

目的：探討內(nèi)皮素-1（ET-1）在心房顫動(dòng)（房顫）和心房纖維化中的作用。

方法：72例開胸手術(shù)患者，分為房顫組（39例）和竇性心律（竇律）組（33例）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及蛋白免疫印跡（Western blot）分別檢測兩組患者右心耳ET-1、血小板衍生生長因子-B（PDGF-B）、I型膠原（COL1）mRNA和蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，檢測ET-1刺激以及非選擇性ET-1受體拮抗劑（磺胺異惡唑，Sulfafurazole，SIZ）對H9c2細(xì)胞PDGF-B mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。

結(jié)果：（1）房顫組患者右心耳ET-1 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平明顯高于竇律組（2.830±2.276 vs 1.220 ±0.887）和（0.835±0.241 vs 0.286±0.083），P均<0.01。房顫組患者右心耳PDGF-B mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平明顯高于竇律組（2.568±2.348 vs 1.567±0.831）和（0.807±0.241 vs 0.381±0.105），P均<0.05。房顫組患者右心耳I型膠原α1亞基（COL1α1） mRNA表達(dá)水平（3.376±1.598） 明顯高于竇律組（1.629±0.833），P<0.05；蛋白表達(dá)水平（0.652±0.210）亦明顯高于竇律組（0.312±0.122），P<0.05。（2）兩組患者右心耳I型膠原蛋白表達(dá)水平與ET-1蛋白表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)（r=0.580，P<0.01）。（3）ET-1促進(jìn)H9c2細(xì)胞分泌PDGF-B，并表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性。SIZ可減輕上述效應(yīng)。

結(jié)論: ET-1在房顫的發(fā)生中起著重要作用，其可能通過調(diào)控PDGF-B促進(jìn)心房纖維化而導(dǎo)致房顫的發(fā)生。