杜 泰 陳學情 杜華茂

(1. 西南大學附屬中學， 重慶 400714； 2. 西南大學生物技術(shù)學院， 重慶 400716)

一種抗菌絲綢的制備及其抗菌作用分析*

杜 泰1陳學情2杜華茂2

(1. 西南大學附屬中學， 重慶 400714； 2. 西南大學生物技術(shù)學院， 重慶 400716)

桑蠶絲是一種與人體組織相容性極好的天然蛋白纖維，抗菌蠶絲在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域有廣泛的應用前景。本文探索了直接在絲綢上嫁接納米銀的方法。用紅外光譜儀分析自制的納米銀樣品，發(fā)現(xiàn)在1 651cm-1，1 584cm-1，1 379cm-1， 1 033cm-1有特征峰，表明納米銀結(jié)合蛋白質(zhì)。用戊二醛處理絲綢后加入納米銀膠體溶液，室溫下處理10h, 在掃描電子顯微鏡下觀察絲綢上納米銀的結(jié)合狀態(tài)，并按《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》測定處理后絲綢的對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌的抗菌性能。結(jié)果顯示絲綢上的納米銀以分散狀、成簇存在；在20min內(nèi)，2cm ×3cm大小絲綢對104CFU/ml細菌的殺菌率達到90%。研究表明，用戊二醛將結(jié)合了蛋白質(zhì)分子的納米銀嫁接到蠶絲蛋白上可制備抗菌絲綢。

絲綢；納米銀；抗菌

蠶絲纖維是一種蛋白質(zhì)纖維，是由18種天然氨基酸組成的天然高分子材料[1]。由蠶絲紡織而成的絲綢質(zhì)地柔軟纖細光滑，手感細膩，與人體體表有良好的適應性。近年發(fā)現(xiàn)蠶絲纖維在體內(nèi)穩(wěn)定性較好，也可緩慢降解，表現(xiàn)出良好的組織相容性，已用于制備外科合線和再造血管等[2-3]。具有抗菌作用的蠶絲在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)⒂懈鼜V泛的應用。目前有大量抗菌蠶絲的研究報道，主要是對絲膠或絲束進行抗菌物質(zhì)的嫁接[4-5]，特別是嫁接納米銀的蠶絲抗菌作用強，抗菌譜廣[4，6]。對于需要加工成織物才能進行抗菌性應用的蠶絲，后期加工過程對蠶絲結(jié)合的納米銀將有不同程度的影響，或者說為保持其抗菌作用，在后期加工工藝上會做出某些犧牲。本研究報道一種在絲綢上直接嫁接納米銀的方法并分析其抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

納米銀由本實驗室自制，按專利ZL 2012 1 0579134.4制備[7-8]。絲綢購于四川省南充市愛膚爾絲綢有限公司。戊二醛(分析純，25%)。LB 培養(yǎng)基為上海生物工程公司產(chǎn)品。大腸桿菌CVCC2081，金黃色葡萄球菌CVCC1882，白色念珠菌CMCC(F)98001由黃偉博士惠贈。

1.2 紅外光譜分析

取100mL納米銀膠體溶液經(jīng)12 000r/min離心濃縮后再冷凍干燥。取1mg納米銀粉與120mg溴化鉀充分研磨混合后壓片，用傅立葉紅外光譜儀(IR-6700，美國尼高立)作4 000cm-1-400cm-1波數(shù)掃描，采集紅外光譜圖并進行官能團分析。

1.3 納米銀的嫁接

剪取1M2絲綢，放入4%戊二醛PBS溶液中，在室溫浸泡12h后用去離子水洗滌3次，以去除殘留的戊二醛分子。將絲綢轉(zhuǎn)入10 ppm的溶液中浸泡12h，用去離子水洗滌3次去除未結(jié)合的納米銀。至此，納米銀已嫁接到絲綢上，閉光保存。

1.4 掃描電鏡分析

將處理的絲綢自然干燥后送北京中科百測分析測試中心進行掃描電鏡分析，觀察絲綢表面納米銀的形態(tài)。

1.5 絲綢的抗菌性能分析

按《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》(GB15979-2002)附錄三進行抗菌性檢測。主要步驟如下，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于LB培養(yǎng)基，白色念珠菌接種于土豆培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后離心收集菌體，用PBS將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌濃度調(diào)至2×105CFU/mL，將白色念珠菌調(diào)為2×104CFU/mL。

將絲綢剪為2cm × 3cm大小，放入5mL滅菌的試管中。每張絲綢片上加菌液100μL。每種菌作6張絲綢小片。室溫放置10min、20min后分別取出3片絲綢，每片加5mL 終止液。對照組的絲綢用75%乙醇浸泡30min后用滅菌水洗滌。取100μL涂瓊脂平板進行菌落計數(shù)，每個處理樣品取三份計數(shù)。試驗重復三次，計算平均殺菌率，并進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 納米銀的紅外光譜特征

本研究所用的納米銀是由赤霉菌的菌絲裂解物在室溫下所合成,所制備出的納米銀膠體溶液Zeta電位為-33 eV，表現(xiàn)為自穩(wěn)定的特性[8]。將該納米銀用去離子水充分洗滌后進行紅外光譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 651cm-1、1 584cm-1有特征峰，分別代表伯胺與仲胺基團的振動，在1 379cm-1、 1 033cm-1有特征峰，代表芳香族氨基和脂肪族氨基的C-N基團的振動(見圖1)，表明該納米銀結(jié)合有蛋白質(zhì)。

2.2 絲綢表面的納米銀

因紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)赤霉菌菌絲裂解物合成的納米銀結(jié)合有氨基，所以可用戊二醛將其與蠶絲蛋白的α氨基進行偶聯(lián)，達到將納米銀嫁接到蠶絲纖維上的目的。嫁接過程在室溫下由兩步反應完成，先將戊二醛與蠶絲蛋白結(jié)合，再與納米銀結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合。在掃描電鏡下清晰可見蠶絲纖維編織的規(guī)律紋理(圖2A),在500倍下可見蠶絲纖維表面附著有顆粒物，這些顆粒物分散存在，大小不一(圖2B)。一根絲束表面局部的附著物呈堆出現(xiàn)(1萬倍)，在2.5萬倍下可見球狀的納米銀(圖2 C，D)。

圖1 赤霉菌合成納米銀的紅外光譜圖

圖2 處理后絲綢織物的超微結(jié)構(gòu)

圖3 處理后絲綢的抗菌作用

2.3 處理后絲綢織物的抗菌作用

按《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》(GB15979-2002) 附C3介紹的方法測定嫁接納米銀的絲綢織物對大腸桿菌CVCC2081、金黃色葡萄球菌CVCC1882及白色念珠菌CMCC(F)98001的殺菌率。菌液在絲綢織物上保留10min、20min后測定的殺菌率如圖3所示，由圖可知處理10min對三類微生物的殺菌率在50%左右，對金黃色葡萄球菌的殺菌率略低；處理20min均超過90%。

3 小結(jié)與討論

蠶絲從中國走向世界，為人類服務了數(shù)千年，贏得了“纖維皇后”之美稱，蠶絲織物也享有“人體第二皮膚”的高度評價?，F(xiàn)代生物學和現(xiàn)代醫(yī)學正試圖證明蠶絲在人類健康相關(guān)的諸多領(lǐng)域有更重要的應用價值[1-2]。抗菌蠶絲及抗菌蠶絲織物是其中一個研究方向，可以用于多種感染性疾病的治療，比如燒傷和糖尿病足的治療。

納米銀是目前最有效的抗菌材料之一，利用活性氧對蛋白質(zhì)、脂類和核酸的廣泛破壞作用發(fā)揮其殺滅細菌、真菌和病毒的功能?；钚匝醯漠a(chǎn)生有兩種途徑，一方面是納米銀不斷釋放的銀離子，另一方面納米銀本身。因此，從理論上講，只要使蠶絲結(jié)合上納米銀，就負于其抗菌性能。人們探索了多種方法將納米銀修飾到蠶絲或嫁接到蠶絲織物表面[4-5]。本文報道了一種相對簡單的方法，利用戊二醛對蛋白質(zhì)的偶聯(lián)作用將納米銀結(jié)合到蠶絲織物表面，處理后的絲綢的殺菌率達到了90%。這一方法的可行性主要得益于近年來興起的生物法合成納米銀技術(shù)，即利用細菌或真菌還原硝酸銀，生成的納米銀可與反應體系中蛋白質(zhì)的氨基、巰基結(jié)合，以形成穩(wěn)定的納米銀膠體。本研究用紅外光譜儀檢測赤霉菌合成納米銀樣品中有伯氨、仲氨及芳香族氨基酸的C-N等基團的特異性振動峰，這與先前的報道相一致[10]。

抗菌蠶絲在臨床上的應用尚需大量實驗數(shù)據(jù)的支撐，除生物學角度的研究外，還需要醫(yī)學相關(guān)人員的加入，以評價其作為外科敷料或填料在組織學上的可行性。

致謝：感謝劉英帥博士在紅外光譜分析中的技術(shù)支持。

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*資助項目：中央高?；緲I(yè)務費專項基金(XDJK2016E105)。

杜華茂，博士，副教授。Email: duhmao@swu.edu.cn