郭麗梅,杜　娟,廖　鷹,李　揚(yáng),王光熙,劉　巖

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系，北京 100091)

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Hedgehog信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

郭麗梅,杜娟,廖鷹,李揚(yáng),王光熙,劉巖

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系，北京 100091)

[摘要]目的探討Hedgehog信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(Gli1)蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及作用。方法免疫組化法檢測Gli1蛋白在147例手術(shù)切除結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)；Western blotting法檢測Gli1蛋白在19例結(jié)直腸癌新鮮組織和2個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)；同時(shí)用共聚焦激光顯微鏡觀察Gli1轉(zhuǎn)錄水平的抑制劑GANT61對(duì)8例直腸癌組織中直接分離的腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)果147例結(jié)直腸癌根治切除標(biāo)本中，Gli1蛋白在78.2%(115/147)的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，陽性信號(hào)表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿。Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤前緣腫瘤細(xì)胞團(tuán)數(shù)目、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。在5例Gli1蛋白陽性的結(jié)直腸癌組織中，間質(zhì)細(xì)胞，包括腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)Gli1蛋白。Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織和2個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)也升高。對(duì)結(jié)直腸癌組織中直接分離出的腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)以后加入GANT61，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)Gli1蛋白的表達(dá)，而對(duì)腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞沒有顯著影響。結(jié)論Gli1蛋白的活化可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展；GANT61可能為進(jìn)展期結(jié)直腸癌的治療提供新的契機(jī)。

[關(guān)鍵詞]Hedgehog信號(hào)通路；腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1；結(jié)直腸癌；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌是胃腸道常見惡性腫瘤，近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期。城市患者發(fā)病高峰在50歲左右，中位發(fā)病年齡比歐美提前約10 a[1-2]。有關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的研究[3-6]表明，多種信號(hào)通路與基因的異常變化參與了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。其中，Hedgehog信號(hào)通路近來被廣泛報(bào)道，該通路功能的異?；罨梢源龠M(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展，已受到越來越多的關(guān)注[5-9]。

Hedgehog信號(hào)通路因調(diào)節(jié)果蠅成體剛毛的形成而得名，眾多研究發(fā)現(xiàn)該通路除了在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中起重要的形態(tài)形成因子作用以外，與人類腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)也緊密相關(guān)。Hedgehog信號(hào)通路的異常激活可以導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，如基底細(xì)胞癌、髓母細(xì)胞瘤、肺小細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、胃腸道惡性腫瘤、淋巴瘤等[10-20]。Hedgehog信號(hào)通路主要由3部分組成：Hedgehog信號(hào)肽(Shh、Ihh、Dhh)、跨膜受體(Ptch)、細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)分子(Smo)、下游轉(zhuǎn)錄因子(Gli)。經(jīng)典途徑中，Hedgehog信號(hào)通路的激活是通過配體Hedgehog與跨膜受體Ptch結(jié)合，進(jìn)而解除Ptch對(duì)另一跨膜蛋白Smo的抑制作用，Smo然后通過激活轉(zhuǎn)錄因子Gli1和(或)Gli2，進(jìn)而促進(jìn)一系列下游靶基因轉(zhuǎn)錄，其中包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤血管生成等眾多基因的轉(zhuǎn)錄[10-11,21-23]。此外，有研究[24-26]發(fā)現(xiàn)Gli1可以不經(jīng)過Hedgehog配體引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、而由PI3K/AKT、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、K-ras等直接活化。以上發(fā)現(xiàn)提示，無論經(jīng)典途徑或非經(jīng)典途徑，Gli1的活化對(duì)腫瘤發(fā)生和發(fā)展都非常重要。本研究旨在通過觀察Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)狀況，確立其在腫瘤演進(jìn)過程中的作用，并初步探討針對(duì)Gli1的小分子化合物GANT61對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。

1材料與方法

1.1材料收集2009年至2013年在北京大學(xué)第三醫(yī)院進(jìn)行的術(shù)前未經(jīng)過新輔助治療的結(jié)直腸癌患者147例，其中腫瘤限于黏膜下層內(nèi)者29例，浸潤至肌層或更深部腸壁者118例。從19例至少為肌層浸潤的病例獲得結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜組織，其中有8例腫瘤組織同時(shí)用于直接分離腫瘤細(xì)胞。

1.2試劑Gli1抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗、DAB試劑盒購自丹麥Dako公司；GANT61購自德國Merck公司；結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116、DLD-1)購自美國ATCC細(xì)胞庫。

2結(jié)果

2.1Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中原位表達(dá)的觀察結(jié)果147例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，Gli1蛋白在78.2%(115/147)的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，陽性信號(hào)表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿。在5例Gli1蛋白陽性的結(jié)直腸癌組織中，間質(zhì)細(xì)胞，包括腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿也表達(dá)有Gli1蛋白(圖1)。對(duì)結(jié)直腸癌根治標(biāo)本冰凍切片中Gli1蛋白進(jìn)行免疫熒光染色后共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)(圖2)。Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)結(jié)直腸癌浸潤前緣腫瘤細(xì)胞團(tuán)數(shù)目、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，即Gli1蛋白的表達(dá)水平越高，腫瘤浸潤層次越深、浸潤前緣腫瘤細(xì)胞團(tuán)數(shù)目越多、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率越高、TNM分期越高(表1)。

圖1　免疫組化顯示不同結(jié)直腸組織中Gli1蛋白的表達(dá)

A:正常直腸(×200)；B:進(jìn)展期結(jié)腸腺癌(×100)；C:進(jìn)展期直腸腺癌(×200)；D:進(jìn)展期直腸腺癌中腫瘤間質(zhì)內(nèi)腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞和脈管內(nèi)皮細(xì)胞(×200)

圖2　免疫熒光染色后共聚焦

2.2Western blotting法半定量分析Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)Western blotting結(jié)果顯示，在42.1%(8/19)的進(jìn)展期結(jié)直腸癌組織中，Gli1蛋白的表達(dá)明顯升高(圖3)。在2個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中，Gli1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)強(qiáng)于細(xì)胞漿(圖4)。

2.3GANT61對(duì)結(jié)直腸癌分離腫瘤細(xì)胞生長的影響加入針對(duì)Gli1轉(zhuǎn)錄水平的小分子化合物抑制劑GANT61，原位觀察GANT61對(duì)8例結(jié)直腸癌組織分離、培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)加入DMSO的對(duì)照組中，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)Gli1蛋白均有表達(dá)；加入GANT61之后，Gli1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)明顯減弱(圖5)。而對(duì)于纖維母細(xì)胞，加入DMSO或GANT61后,Gli1蛋白的陽性信號(hào)沒有明顯變化，在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中仍均有表達(dá)(圖6)。

3討論

Hedgehog基因作為一種重要的胚胎形態(tài)發(fā)育調(diào)控因子，最早被確認(rèn)參與體內(nèi)多種器官和組織的發(fā)育成熟。出生后，Hedgehog蛋白僅少量表達(dá)于呼吸道、胃腸道等上皮內(nèi)的基底干細(xì)胞。Hedgehog通路成員基因的異常表達(dá)則會(huì)啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞異常分裂增殖，從而導(dǎo)致腫瘤形成[6,10]。大量研究[5-6，21-26]證實(shí)Hedgehog信號(hào)通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)，可能的致癌途徑有3個(gè)：1)通過配體Shh蛋白表達(dá)：內(nèi)源性Shh過表達(dá)，并與受體Ptch結(jié)合，從而解除后者對(duì)下游因子Smo的抑制作用，促使全長的Gli1或Gli2進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)靶基因；2)Ptch和(或)Smo發(fā)生突變：導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)失控，靶基因不斷激活；3)不經(jīng)由Hedgehog/Ptch/Smo的級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，而是由PI3K/AKT、TGF-β1、K-ras等直接激活Gli1或Gli2,促進(jìn)下游靶基因活化。除調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展外，Hedgehog信號(hào)通路還參與炎癥修復(fù)、血管新生等過程[27-29]。

本研究納入的結(jié)直腸癌患者個(gè)體化根治組織標(biāo)本中，Gli1蛋白在多數(shù)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞及少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞Gli1蛋白表達(dá)的陽性比例和陽性信號(hào)越高，腫瘤的浸潤和侵襲行為越強(qiáng)，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率越高，TNM分期越高。這些結(jié)果提示Gli1蛋白高表達(dá)的患者，其腫瘤的生物學(xué)行為可能更差，常規(guī)輔助治療效果可能不理想，預(yù)后差。

有關(guān)Hedgehog信號(hào)通路抑制劑的研究很多。其中，環(huán)巴胺，一種從百合科藜蘆屬植物中提取的異甾體類生物堿，通過與Smo結(jié)合而阻斷Hedgehog信號(hào)通路傳導(dǎo)的作用機(jī)制得到揭示。由環(huán)巴胺衍生的另一抑制劑Vismogib(GDC0449)目前正在臨床應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性基底細(xì)胞癌患者的治療。而針對(duì)Gli轉(zhuǎn)錄水平的抑制劑GANT61可能對(duì)抑制Hedgehog信號(hào)通路的功能更為重要[22-23,29-31]。本研究中，我們向直接分離、培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞與腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞內(nèi)加入GANT61,發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Gli1蛋白的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)有明顯抑制，部分腫瘤細(xì)胞核Gli1蛋白表達(dá)減弱，而對(duì)纖維母細(xì)胞沒有明顯影響。我們推測GANT61可能通過抑制Gli1入核或抑制Gli1與靶基因的結(jié)合，無法轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因，從而抑制細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞死亡。這提示GANT61有可能作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，但其對(duì)腫瘤生長依賴的微環(huán)境的改善與抑制效果有限。

表1Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

項(xiàng)目n染色比例陽性陰性P染色程度評(píng)分P年齡/歲 ≤50282172.165±0.367 >501199425>0.052.133±0.500>0.05性別 男7657192.705±0.778 女715813>0.052.367±0.800>0.05腫瘤位置 右半結(jié)腸4732151.900±0.037 左半結(jié)腸19154>0.052.533±0.300>0.05 乙狀結(jié)腸262151.820±0.073 直腸554782.100±0.920組織學(xué)類型 管狀腺癌8668182.367±0.466 黏液腺癌39318>0.051.945±0.183>0.05 印戒細(xì)胞癌221662.515±0.300病理分化程度 高分化191362.867±0.766 中分化655114>0.052.367±0.621>0.05 低分化6351123.005±0.805浸潤前緣癌細(xì)胞數(shù) ≤52710170.420±0.074 >5~1054468<0.051.670±0.260<0.05 >10665972.896±0.167浸潤深度 黏膜下297222.800±0.365 肌層35278<0.052.225±0.036>0.05 漿膜下層494722.133±0.460 漿膜343223.024±0.537脈管瘤栓 有5242102.610±0.133 無957322>0.053.100±0.720>0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N05833251.300±0.200 N1~289827<0.053.000±0.533<0.05臨床分期 Ⅰ~Ⅱ期6736311.327±0.020 Ⅲ~Ⅳ期80791<0.053.055±0.133<0.05

圖3　Western Blotting結(jié)果示19例進(jìn)展期直腸癌和正常直腸黏膜組織中Gli1蛋白表達(dá)水平

圖4　Western blotting結(jié)果示2個(gè)

圖5　共聚焦激光顯微鏡示結(jié)直腸癌分離

圖6　共聚焦激光顯微鏡示結(jié)直腸癌分離腫瘤相關(guān)

Gli1蛋白在多數(shù)進(jìn)展期直腸癌組織中表達(dá)水平升高，提示其功能的持續(xù)活化。在結(jié)直腸癌發(fā)生和演進(jìn)過程中，Hedgehog信號(hào)通路可能通過2種不同的激活方式起作用，即依賴于Shh配體以及不依賴于Shh激活的可能性。進(jìn)一步的研究需要結(jié)合Gli1表達(dá)與其他促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生和演進(jìn)的分子途徑，觀察如Wnt/APC通路、PTEN等，關(guān)注與Hedgehog信號(hào)通路的相互作用。因此,Hedgehog已不是一條單一的信號(hào)通路，而更像是一個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)，更多Gli1非配體依賴的活化途徑需要證實(shí)。例如Gli1的活化可能受K-ras基因突變的影響，有必要結(jié)合腫瘤細(xì)胞K-ras基因點(diǎn)突變檢測的相關(guān)性分析。由于本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以針對(duì)Gli1蛋白的分析可以更好區(qū)分開Hedgehog信號(hào)通路活化與非活化組，活化組的患者其腫瘤惡性行為更兇，預(yù)后可能更差，應(yīng)采用不同的治療方案。

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Expression of Hedgehog Signal Path Transcription Factor Gli1 in the Human Colorectal Carcinoma

Guo Limei,Du Juan,Liao Ying,Li Yang,Wang Guangxi,Liu Yan

(DepartmentofPathology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100091,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression and significance of Hedgehog signal path transcription factor glioma associated oncogene 1 (Gli1) in the human colorectal carcinoma.MethodsExpressions of Gli1 protein was detected and evaluated in the 147 cases of human colorectal carcinoma by immunohistochemistry.Western blotting was used to analyze Gli1 protein in the fresh colorectal carcinoma tissues and the two cell lines of colon carcinoma.Additionally,the carcinoma cells directly isolated from 8 cases of colorectal carcinoma tissues were added with GANT61,and were observed by confocal laser microscopy.ResultsGli1 protein was detected in the nucleus and cytoplasm of carcinoma cells in the 78.2% (115/147) of the 147 cases of human colorectal carcinoma.Statistically,the expression of Gli1 protein in the human colorectal carcinoma was significantly correlated with the tumor cell clusters of invasion edge,deepness of tumor invasion,lymph node metastasis,and TNM staging,respectively (P<0.05).In 5 cases of human colorectal carcinoma with positive expression of Gli1 protein,Gli1 protein was also detected in the tumor stroma cells,including cancer associated fibroblasts and endothelial cells.Gli1 protein high expression was confirmed by Western blotting in the carcinoma tissues and the two cell lines.In addition,GANT61 inhibited the expression of Gli1 protein in the carcinoma cells isolated from the CRC tissues significantly,but not for the carcinoma-associated fibroblasts.ConclusionOverexpression of Gli1 protein may involve in the progression of human colorectal carcinoma through increasing tumor invasion and metastasis; furthermore,GANT61 may be a new drug for the therapy of advanced CRC.

[Key words]Hedgehog signal path; glioma associated oncogene 1; colorectal carcinoma; immunohistochemistry

(收稿日期：2015-11-30)

[中圖分類號(hào)]R735.3；R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5412(2016)01-0001-06

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.01.001

作者簡介：郭麗梅(1973-)，女，博士，副教授，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤病理診斷及研究。E-mail: guolimei@bjmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30700349)；國家自然科學(xué)基金主任專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30440012)；北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：Z131100004013036)