， ， ， (山西大同大學(xué) .生命科學(xué)學(xué)院; .綜合分析與測試中心， 山西 大同 037009)

鹽旱交叉脅迫對大豆萌發(fā)期保護酶的影響

張永芳a，王潤梅a，趙麗華b，劉麗萍a
(山西大同大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院; b.綜合分析與測試中心， 山西 大同 037009)

為了研究鹽旱交叉脅迫對大豆萌發(fā)期保護酶活性的影響，以中黃25號大豆為試驗材料，采用水培法培養(yǎng)并對其進行鹽旱交叉脅迫處理，測定脅迫下過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性變化。結(jié)果表明：鹽旱交叉脅迫下，隨著脅迫程度的加劇，CAT活性整體呈下降趨勢，其中180 mmol/L NaCl和25%～30% PEG-6000交叉脅迫處理時，CAT活性明顯高于其它處理組；在同一鹽分濃度和不同濃度PEG-6000交叉脅迫下， PEG-6000濃度梯度為20%，25%和30%時，隨著PEG-6000濃度的增加，POD活性基本都呈下降趨勢；但在同一PEG-6000濃度和不同鹽濃度的交叉脅迫下，隨著NaCl濃度的增加，POD活性卻逐漸升高。以上結(jié)果表明,在150 mmol/L NaCl鹽、20% PEG-6000旱脅迫下，大豆可通過調(diào)節(jié)其保護酶活性以適應(yīng)逆境，增強抗鹽、抗旱能力。

大豆； 鹽旱交叉脅迫； 保護酶

大豆是優(yōu)質(zhì)蛋白和食用油脂的重要來源，在我國長江流域，黃河流域，江南以及東北三省，西南等地區(qū)多有種植，然而近幾年來，其產(chǎn)量卻呈下降趨勢，原因是隨著環(huán)境條件的變化，植物往往同時或相繼經(jīng)受多種環(huán)境脅迫[1]，特別是鹽脅迫和干旱脅迫，導(dǎo)致不能滿足大豆各生育期需水量，使得根系欠發(fā)達，吸水困難[2]。因此，如何有效利用這些鹽旱土壤，提高大豆產(chǎn)量成為目前農(nóng)業(yè)研究的主要課題之一。

聚乙二醇(PEG)作為一種高分子滲透劑，親水性較強[3]，不能穿越植物細胞壁進入細胞質(zhì)而引起質(zhì)壁分離，因此可人工模擬干旱脅迫；氯化鈉作為高濃度物質(zhì)也可使細胞滲透失水而發(fā)生質(zhì)壁分離、膜透性增加，膜內(nèi)大量離子外滲[4-8]，膜外大量Na+進入細胞內(nèi)膜，細胞內(nèi)膜兩邊離子失去平衡。

目前，關(guān)于鹽或干旱單一耐性對大豆影響的研究較多。陳慶華研究了干旱脅迫對大豆苗期葉片保護酶活性等的影響，結(jié)果表明：隨著干旱脅迫的加強，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等的活性表現(xiàn)為先升后降的趨勢，輕度脅迫下質(zhì)膜透性和丙二醛含量增幅較小，重度脅迫時增幅明顯增大[9]。李建英等研究指出，干旱脅迫后化控種衣劑能提高大豆幼苗葉片POD和SOD的活性，提高抗旱性[10]；高亞梅等研究了不同大豆品種在干旱脅迫下各相關(guān)酶系的變化，結(jié)果表明：干旱脅迫下大豆根中SOD，POD，CAT活性增加顯著，從而得出SOD、POD、CAT都是大豆保護酶系統(tǒng)的重要組成部分的結(jié)論[11]；許東河等研究了鹽脅迫對大豆生理指標(biāo)的影響，表明膜脂質(zhì)過氧化是大豆鹽傷害的重要原因[12]。但是針對鹽和干旱交叉脅迫對大豆影響的研究卻鮮有報道。

本研究擬以中黃25號大豆為實驗材料，研究其萌發(fā)期在鹽旱交叉脅迫下生理指標(biāo)變化，探尋最有利于大豆生長的鹽濃度和PEG濃度，為更好地利用鹽堿土，提高大豆產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材 料

試驗材料為中黃25號大豆種子。

1.1.2 儀 器

恒溫培養(yǎng)箱、SP-754型紫外分光光度計(上海博迅實業(yè)有限公司)、ST 16 R型臺式高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)、BS 223 S型精密電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 種子處理及試驗設(shè)計

選用籽粒大小均勻、飽滿的中黃25號大豆種子，用清水將其沖洗干凈，然后經(jīng)0.1% HgCl2溶液消毒8～9 min后，用蒸餾水沖洗3～4次，最后用溫水(25 ℃)將其避光浸泡72 h左右進行催芽，待其胚芽長到1.5 cm左右時，全部放置到鋪有3層濾紙、噴以Hoagland營養(yǎng)液(以剛浸濕濾紙為宜)的干凈培養(yǎng)皿中，各培養(yǎng)皿放置6粒大豆種子，以進行相應(yīng)的脅迫處理。本次試驗采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，包括1個對照， 9個鹽旱交叉脅迫處理，其中，3個鹽分脅迫處理梯度為S 1(120 mmol/L)，S 2(150 mmol/L)和S 3(180 mmol/L)NaCl溶液，每個處理3次重復(fù)。以PEG-6000人工模擬干旱脅迫。3個干旱脅迫梯度為輕度脅迫T 1(PEG-6000濃度為20%)，中度脅迫T 2(PEG-6000濃度為25%)，重度脅迫T 3(PEG-6000濃度為30%)。

1.3 試驗方法及處理

鹽旱脅迫各處理中，每個培養(yǎng)皿每次加3 mL NaCl溶液和3 mL PEG-6000溶液。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 測定指標(biāo)

脅迫處理10 d后選取發(fā)芽勢好的大豆種子，先用蒸餾水沖洗一下，以清除豆子表面殘留的NaCl溶液和PEG-6000溶液，然后稱取0.5～1.0 g測定其保護酶活性，每個處理隨機取樣。采用紫外吸收法測定CAT的活性，用愈創(chuàng)木酚法測定POD的活性。每個處理以1 min內(nèi)A240降低0.1為1個CAT酶活性單位；以470 nm波長下，每分鐘OD增加0.01定義為1個POD酶活性單位。

1.4.2 測定方法

CAT活性測定：測定方法參照文獻[13]。

POD活性測定：將稱取好的大豆種子1.0 g剪碎置于已在冰中預(yù)冷的研缽中，加少量石英砂和少量磷酸緩沖液(pH=7.0)，冰浴研磨勻漿后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，搖勻。取5 mL于離心管，同樣在4 ℃、15 200 r/min下冷凍離心20 min，上清液即為POD酶液。取10 mL具塞試管3支(3次重復(fù))，各加入酶液1 mL，0.1%愈創(chuàng)木酚1.0 mL，磷酸緩沖液(pH=7.0)1.0 mL，搖勻，加入0.18% H2O21.0 mL后，于25 ℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，最后分別加5%偏磷酸0.2 mL終止反應(yīng)。用蒸餾水調(diào)零，于分光光度計上測定3支試管的A470，每30 s讀數(shù)1次，共測6次。

1.4.3 CAT和POD酶活性計算公式

CAT活性[U/(g·min)]=ΔA240×Vt/0.1×Vs×t×FW

式中，ΔA240為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化值(降低)；Vt為酶提取液總體積(5 mL)；Vs為測定時取酶液的體積(0.1 mL)；t為測定時的總時間(3 min)；FW為樣品鮮重(0.5 g)。

POD活性[U/(g·min)]=ΔA470×Vt/FW×Vs×t

式中，ΔA470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化值(升高)；Vt為酶提取液總體積(5 mL)；Vs為測定時取酶液的體積(1.0 mL)；t為測定時的總時間(3 min)；FW為樣品鮮重(1.0 g)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽旱交叉脅迫下中黃25號發(fā)芽種子中CAT活性變化

由圖1可知，在不同鹽濃度處理下，隨著鹽濃度的增加，CAT活性整體基本上呈下降趨勢。在同一NaCl濃度和不同PEG-6000濃度脅迫下，隨著干旱脅迫程度的增加，CAT活性也基本呈下降趨勢，但在180 mmol/L NaCl和25% PEG-6000交叉脅迫下，CAT活性卻明顯高于另外2個處理組，這說明較高鹽分與干旱交叉脅迫能刺激CAT活性升高，迅速清除過多的自由基，從而防止對膜上以及膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化作用。

圖2表明，在不同濃度PEG處理下，在輕度干旱(20% PEG-6000)脅迫下，隨著鹽分脅迫濃度的增加，CAT活性呈先上升后下降的趨勢。在中度干旱脅迫下，隨著鹽分濃度的增加CAT活性大致呈上升趨勢，同時可以明顯看出，中等濃度150 mmol/L NaCl 脅迫下相對于120 mmol/L NaCl脅迫下的CAT活性略有下降，不顯著(p=0.843gt;0.05)，但在180 mmol/L NaCl脅迫下CAT 活性遠遠高于前兩者，CAT活性在此時達到最大值。可能是它在較高鹽分和干旱的交叉脅迫下活性大增，清除自由基的能力增強，從而避免因自由基積累引發(fā)的膜脂過氧化作用對細胞造成的傷害，因而對高強度的逆境有一定的適應(yīng)能力。在重度干旱和不同鹽分交叉脅迫下，CAT活性相對于輕度和中度干旱脅迫下的都低，這可能是由于脅迫程度加劇，其抗氧化能力降低，自由基大量積累，膜脂發(fā)生過氧化作用，細胞膜遭到破壞，但在這同一重度干旱脅迫水平下，180 mmol/L NaCl脅迫時，CAT活性比前兩者都高。其中，高鹽脅迫與中等鹽脅迫下CAT活性達到顯著差異(p=0.019lt;0.05)。這說明在細胞已遭受嚴重傷害的情況下，CAT還能繼續(xù)維持一定時間的穩(wěn)定性，甚至通過升高活性來盡可能降低自由基對細胞的傷害。這同樣再次說明了中黃25號大豆耐鹽力高的品質(zhì)優(yōu)勢是使其高產(chǎn)的原因之一。

圖1 鹽旱交叉脅迫下CAT活性變化

圖2 鹽旱交叉脅迫下CAT活性變化

通過單因素方差分析，在不同的交叉脅迫下進行多重比較，各個處理組之間CAT活性變化不顯著(p=0.348gt;0.05)，說明不同鹽旱交叉脅迫對CAT的活性影響不是很大，可能CAT不是中黃25號大豆起主要作用的保護酶。

2.2 鹽旱交叉脅迫下中黃25號發(fā)芽種子中POD活性變化

由圖3可知，在同一NaCl濃度和不同濃度的PEG-6000交叉脅迫下，隨著PEG-6000溶液濃度的增加，POD活性基本都呈下降趨勢。但在120 mmol/L NaCl和不同濃度的PEG-6000交叉脅迫下，POD活性先升高后降低，但在輕度干旱(20% PEG-6000)和中度干旱(25% PEG-6000)脅迫下的活性變化達極顯著(p=0.001lt;0.01)，這可能是由于中黃25號大豆具有一定的抗旱性，它能迅速提高POD的活性來清除氧自由基，免除了細胞發(fā)生過氧化，因此，此時的逆境對種子影響不大，種子受水分脅迫較小，產(chǎn)生的氧自由基等不多。

由圖4可知，在同一濃度的PEG-6000和不同濃度的NaCl交叉脅迫下，隨著脅迫程度的加劇，POD活性整體在逐漸下降。而在各同一干旱脅迫水平，即PEG-6000濃度梯度為20%，25%和30%下，隨著NaCl脅迫濃度的增加，POD活性基本呈上升趨勢。在輕度干旱(20% PEG-6000)脅迫處理水平，隨著鹽分脅迫處理濃度的增加，150 mmol/L和180 mmol/L NaCl脅迫下POD活性都升高，在濃度為180 mmol/L NaCl脅迫下達到最大值；在中度干旱脅迫處理水平POD活性變化和上述情況一樣， 這表明中黃25號大豆在一定的較高鹽和干旱交叉脅迫范圍內(nèi)，能通過迅速提高POD活性，清除自由基，免除了氧自由基對細胞質(zhì)膜的破壞作用，維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和生命代謝的正常運行，表現(xiàn)出一定的適應(yīng)能力；在重度干旱脅迫處理水平，POD活性相較于中度干旱脅迫下明顯降低，可能雙重脅迫下，自由基大量產(chǎn)生并積累，胞質(zhì)膜發(fā)生過氧化作用而遭到破壞，同時也可從圖中得知，隨著NaCl脅迫濃度的增加，POD活性基本也呈上升趨勢，在180 mmol/L NaCl脅迫下達到最大值。上述結(jié)果表明，中黃25號大豆具有一定的抗鹽和抗旱能力，雖然隨著二者交叉脅迫程度的增加，POD活性整體下降，但在各個干旱脅迫濃度梯度下，POD活性隨著鹽濃度的增加活性都保持相對較高水平，尤其是在180 mmol/L NaCl脅迫下較150 mmol/L NaCl脅迫下保持較高水平，呈現(xiàn)一定的穩(wěn)定性，這可能與中黃25號為高產(chǎn)大豆品種有關(guān)。

用單因素方差分析，在不同的交叉脅迫下，通過多重比較，各個處理組整體之間POD活性變化不顯著(p=0.175gt;0.05)。但是，在低鹽與重度干旱交叉脅迫處理組下POD活性和高鹽與輕度干旱交叉脅迫處理組下POD活性有顯著差異(p=0.029lt;0.05)；在中等鹽脅迫處理水平下，輕度干旱和重度干旱脅迫下的POD活性達到顯著差異(p=0.027lt;0.05)；同樣，在高鹽脅迫處理水平下，輕度干旱和重度干旱脅迫下的POD活性也達到顯著差異(p=0.05)。此外，在中等鹽與重度干旱脅迫處理組下POD活性有顯著差異(p=0.013lt;0.05)。以上結(jié)果說明，POD是中黃25號大豆保護系統(tǒng)中主要的保護酶之一。

圖3 鹽旱交叉脅迫下POD活性變化

3 討論與結(jié)論

自由基傷害學(xué)說認為，植物細胞中存在著能清除活性氧自由基的保護酶系，如CAT、POD等，它們的協(xié)調(diào)作用能有效清除羥自由基、H2O2等自由基，防御膜脂過氧化，使細胞免受其傷害[14]。根據(jù)這個學(xué)說，通過在實驗室內(nèi)人工模擬或?qū)嵉匮芯吭诂F(xiàn)實存在的各種逆境下，不同植物體內(nèi)的保護酶，如SOD、CAT、POD活性的變化，以此來作為植物抗逆性強弱的一種指標(biāo)，同時也可以作為鑒定特定品種特性的依據(jù)。

本研究以高產(chǎn)大豆品種中黃25號進行了不同的鹽旱交叉脅迫處理，結(jié)果表明：中黃25號大豆具有較強的抗鹽與抗旱性，且抗鹽能力更高，它的CAT和POD活性在高鹽和各種水平的干旱交叉脅迫下仍能保持相對較高的活性和穩(wěn)定性，甚至有活性升高的表現(xiàn)。其中CAT活性和POD活性在20% PEG-6000和150 mmol/L NaCl交叉脅迫處理下都處于較高水平，同時最有益于大豆的生長。而保護酶起著關(guān)鍵作用，可清除自由基，防止自由基對膜上和膜內(nèi)的不飽和脂肪酸的氧化，保護膜的完整性使種子免受傷害。由于實驗條件的限制，本實驗僅僅對發(fā)芽期大豆的2個保護酶的活性變化進行了研究，其他大豆苗期在鹽旱交叉脅迫下保護酶活性變化有待進一步探討。

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Effects of Salt and Drought Intercross Stresses on Activity of Protective Enzymes in Germination Stage of Soybean

ZHANGYongfanga，WANGRunmeia，ZHAOLihuab，LIULipinga

2016-06-30

山西大同大學(xué)校級科研項目(編號：2015 Q 15)。

張永芳(1982—)，女，山西朔州人；講師，碩士，研究方向：植物生理及分子生物學(xué)；E-mail:107987188@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.096

S 565.1

A

1001-4705(2016)11-0096-04