王　征，劉建利，王翠玲，唐志書，宋中興

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，

陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室 陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712083;

2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，西安 710069)

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丹參寒熱藥性的實驗評價

王征1，劉建利2，王翠玲2，唐志書1，宋中興1

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，

陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室 陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712083;

2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，西安 710069)

摘要：目的通過前期建立的中藥寒熱藥性的細(xì)胞評價方法評價中藥丹參的寒熱藥性。方法用噻唑藍(lán)(MTT)比色法考察丹參對SGC-7901細(xì)胞體外增殖的影響，倒置顯微鏡觀察丹參對細(xì)胞形態(tài)特征的影響，臺盼藍(lán)染色法分析丹參的細(xì)胞毒作用。結(jié)果丹參在所選濃度5～800 μg/mL內(nèi)對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響表現(xiàn)為抑制。形態(tài)學(xué)觀察表明丹參能使細(xì)胞密度減小，細(xì)胞固縮變圓，顆粒感增加。臺盼藍(lán)染色表明丹參對這兩種細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用。結(jié)論丹參性寒，與《本經(jīng)》《本草綱目》《中藥學(xué)》所述一致，對所用細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用。

關(guān)鍵詞：丹參;MTT法;SGC-7901細(xì)胞;臺盼藍(lán)染色

丹參始載于《本經(jīng)》，為唇形科多年生草本植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖[1]。其性味《本經(jīng)》和《本草綱目》記載為苦，微寒?！侗静萁?jīng)疏》記載為苦，微溫?！吨兴帉W(xué)》記載為性味苦，微寒[2]。以上文獻(xiàn)研究表明在傳統(tǒng)臨床用藥中對丹參寒熱藥性的認(rèn)識存在較大的分歧。因此通過科學(xué)的實驗方法對丹參的寒熱藥性進(jìn)行評價就尤為必要。本實驗室在前期的工作中，基于細(xì)胞模型建立了評價中藥寒熱藥性的方法[3-5]。該方法基于溫?zé)崴幙梢允股矬w的生理功能亢奮，而寒涼藥則表現(xiàn)為抑制[6]。這在動物模型上也有體現(xiàn)，如用寒藥造?？梢允箘游锏捏w溫降低，中樞興奮抑制以及代謝減慢，而熱藥的作用則相反[7-9]。由此可以推測，寒熱藥對生物體最小的組成單位——細(xì)胞也應(yīng)該有一定的影響，即寒藥會抑制細(xì)胞的生長增殖，而熱藥則會表現(xiàn)出促進(jìn)作用。在前期的工作中已經(jīng)驗證了這一想法，并且已經(jīng)建立了評價中藥寒熱藥性的簡便方法。本文把該方法應(yīng)用于古今寒熱藥性有爭議的丹參，希望用實驗方法解決爭議。

1材料

1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，由第四軍醫(yī)大學(xué)提供。

1.2實驗儀器電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)、滅菌鍋(四川新德醫(yī)療器械)、μQuant 酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)、W201恒溫水浴搖床(上海申生科技有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、倒置光學(xué)顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)、5424R高速離心機(jī)(德國Eppendorf)、超凈工作臺( 蘇州安泰)。

1.3藥品與試劑丹參(購自西安市藻露堂醫(yī)藥超市,由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院房敏峰高級工程師鑒定為正品藥材)、MTT、DMSO、自配PBS(磷酸緩沖液)、0.25%胰蛋白酶(西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司)、臺盼藍(lán)染料(西安沃爾森生物技術(shù)有限公司)、Hyclone 改良型RPMI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)、四季青無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。

2方法

2.1受試藥品溶液的制備稱取丹參20 g,微火煎煮30 min，重復(fù)3次,合并水煎液,濃縮,定容至20 mL,質(zhì)量濃度為1 g/mL。將藥液在10 000 r/min，離心30 min,取上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,最后用無菌水稀釋至10 mg/mL,備用。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將SGC-7901細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，傳代于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，靜置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3MTT試驗取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，將細(xì)胞消化，接種于96孔細(xì)胞板上，然后加入200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基。實驗設(shè)8個濃度梯度，分別為5、10、20、50、100、200、400、800 μg/mL，同時設(shè)置對照組，每組3個重復(fù)孔。加藥完畢后繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，更換培養(yǎng)基，然后每孔加入新配置的噻唑藍(lán)溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min(60次/min)后, 用酶聯(lián)免疫標(biāo)定儀測定490 nm處吸光度(A)值。按下列公式計算細(xì)胞抑制率。抑制率為正值表示對細(xì)胞生長增殖有抑制作用,負(fù)值表示對細(xì)胞有促增殖作用[10]。實驗重復(fù)3 次。

細(xì)胞抑制率=(1-實驗組A 值/ 對照組A 值)×100%

2.4臺盼藍(lán)染色實驗操作參照上步MTT實驗，將細(xì)胞接種于96孔板后培養(yǎng)48 h，然后更換培養(yǎng)基，加入0.4%的臺盼藍(lán)染液20 μL,5 min后用顯微鏡觀察。

3結(jié)果

3.1MTT法檢測用MTT法分別檢測丹參在5～800濃度范圍內(nèi)SGC-7901細(xì)胞體外增殖的影響，所得實驗數(shù)據(jù)，見表1。

±s，n=3)

注：與空白對照組比較，# <0.05，##P<0.01

由表1可以看出，在5～800 μg/mL濃度范圍內(nèi)，丹參對SGC-7901細(xì)胞的增殖都表現(xiàn)為抑制作用，為了能更加直觀的看出丹參對SGC-7901細(xì)胞的抑制率隨濃度變化的趨勢，以抑制率對濃度作圖，所得曲線，見圖1。

圖1　丹參對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的變化

從圖1中可以直觀的看到丹參對SGC-7901細(xì)胞的增殖整體上表現(xiàn)為抑制，其抑制率隨濃度的增大而增大。丹參對SGC-7901細(xì)胞增殖的最大抑制率所對應(yīng)的濃度為800 μg/mL，最低抑制率對應(yīng)為5 μg/mL。根據(jù)筆者以前所得實驗結(jié)果判斷，丹參性寒。此與《本經(jīng)》《本草綱目》和《中藥學(xué)》所述一致，并為這3種著作所述提供了有力的實驗證據(jù)支撐。

3.2丹參對SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響對照組與加藥組在倒置顯微鏡下觀察拍照，見圖2。

圖2　丹參煎液對SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響

筆者選取400 μg/mL細(xì)胞照片與空白對照組照片比較。由圖中可以清楚的看到與空白對照組相比較，丹參400 μg/mL作用48 h后，與空白對照組比，加藥組的細(xì)胞密度明顯降低，沒有對照組致密，細(xì)胞形態(tài)也有所變化。正常的SGC-7901細(xì)胞其細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈不規(guī)則的多邊形，核膜、核仁輪廓明顯，細(xì)胞致密、延展、扁平。在丹參400 μg/mL作用48 h后細(xì)胞相比于對照組，SGC-7901細(xì)胞變圓，細(xì)胞顆粒感增加，部分細(xì)胞在加藥48 h后脫落，培養(yǎng)基中有懸浮的細(xì)胞殘骸。

3.3臺盼藍(lán)染色經(jīng)臺盼藍(lán)染色實驗發(fā)現(xiàn)處理后未見有著色細(xì)胞，說明丹參在5～800 μg/mL濃度范圍內(nèi)對SGC-7901細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用，是通過抑制細(xì)胞的生長來影響細(xì)胞的增殖。

4結(jié)論

丹參作為傳統(tǒng)的活血調(diào)經(jīng)中藥，對于其寒熱藥性文獻(xiàn)記載不一?！侗静萁?jīng)疏》言其苦，微溫，而《中藥學(xué)》《本經(jīng)》以及《本草綱目》都記載為寒性。中藥的寒熱藥性是在臨床用藥的過程中由臨床工作者根據(jù)自己的經(jīng)驗總結(jié)出來的，由于個體因素的差異，因此對一些中藥的寒熱藥性無法形成統(tǒng)一的認(rèn)識[11-12]。本文根據(jù)前期建立的評價中藥寒熱藥性的方法對丹參的寒熱藥性進(jìn)行了評價。在5～800 μg/mL濃度范圍內(nèi)丹參對SGC-7901細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出抑制的作用。且經(jīng)過臺盼藍(lán)染色觀察到丹參對SGC-7901細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。根據(jù)寒藥可能會抑制細(xì)胞生長、代謝以及增殖，而熱藥會表現(xiàn)為促進(jìn)，可以得出丹參性寒。這一結(jié)論與《本經(jīng)》《本草綱目》和《中藥學(xué)》所載一致，在闡明丹參寒熱藥性的同時也為這三部著作的觀點提供了科學(xué)的實驗證據(jù)支撐。

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Evaluating cold and hot characteristic ofSalviamiltiorrhizaBge. by experimental method

WANG Zheng1,LIU Jianli2,WANG Cuiling2,TANG Zhishu1,SONG Zhongxing1

(1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization,Shaanxi province key laboratory of new drugs and Chinese medicine foundation research,Shaanxi rheumatism and tumor center of TCM engineering technology research,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xian Yang 712083,Shaanxi Province,China;2.Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,Ministry of Education,College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Abstract：ObjectiveTo evaluate the cold and hot characteristic ofSalvia miltiorrhiza Bge.by the method we have set up.MethodsMTT assay was used to investigate the effect ofSalvia miltiorrhiza Bge.on the growth of SGC-7901 in vitro.Morphological changes of SGC-7901 treated withSalvia miltiorrhiza Bge.were observed through invert microscope.Trypan-blue staining was used to analyze the cytotoxicity ofSalvia miltiorrhiza Bge.ResultsSalvia miltiorrhiza Bge.can inhibit the growth and proliferation of SGC-7901 in the concentration range of 5-800 μg/mL.Morphological observation showed Salvia miltiorrhiza Bge.in the concentration range we have chosen could decrease the density of SGC-7901 and condense the cell.Trypan-blue staining showedSalvia miltiorrhiza Bge.had no cytotoxicity on SGC-7901.ConclusionThe results show thatSalvia miltiorrhiza Bge.is a cold drug and have no cytotoxicity.

Keywords：Salvia miltiorrhiza Bge.;MTT assay;SGC-7901;rypan-blue staining

(收稿日期:2015-09-15)

文章編號：2095-6258(2016)01-0037-03

中圖分類號：R282.71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：王征(1986-)，男，中藥學(xué)博士，講師，主要從事中藥活性成分的仿生合成與結(jié)構(gòu)修飾研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(20872118);教育部博士點基金(20070697012);陜西省重大科技專項(2008ZDKG-67);陜西省重點實驗室基金(08JZ74,02JS15)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.011