王文革，次苗苗，張俊紅，劉　興

(1.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院兒科，北京100142;2.北京市大興區(qū)紅星醫(yī)院兒科，北京 100076)

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不同劑量生白術(shù)對(duì)慢傳輸型便秘大鼠胃腸道傳輸功能及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響

王文革1，次苗苗1，張俊紅1，劉興2

(1.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院兒科，北京100142;2.北京市大興區(qū)紅星醫(yī)院兒科，北京 100076)

摘要：目的比較不同劑量生白術(shù)對(duì)慢傳輸型便秘大鼠(STC)胃腸道傳輸功能及Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的影響。方法Wistar大鼠40只，分為空白對(duì)照組、模型組、常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組?？瞻讓?duì)照組及模型組給予生理鹽水灌胃,其余各組均給予相應(yīng)藥物灌胃治療，14 d后采用營(yíng)養(yǎng)性半固體糊灌胃法測(cè)定各組大鼠胃殘留率、黑色炭末推進(jìn)率，并采用免疫組化法觀察各組大鼠胃竇、小腸、結(jié)腸組織ICC細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)的變化。結(jié)果常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組與模型組比較，胃殘留率明顯降低(P<0．05)，而二者之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組均可增加黑色炭末推進(jìn)率(P<0．05)，其中大劑量生白術(shù)效果優(yōu)于常規(guī)劑量生白術(shù)(P<0．05)。常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組均可增加c-kit陽性細(xì)胞的面積(P<0．05),而大劑量生白術(shù)優(yōu)于常規(guī)劑量生白術(shù)(P<0．05)。結(jié)論生白術(shù)常規(guī)劑量及大劑量均可促進(jìn)慢傳輸型便秘大鼠的胃動(dòng)力,而在改善其腸道傳輸功能及增加c-kit陽性細(xì)胞面積方面則以大劑量白術(shù)效果為佳。

關(guān)鍵詞：生白術(shù)；慢傳輸型便秘；胃腸動(dòng)力；Cajal間質(zhì)細(xì)胞

慢傳輸型便秘(slow-transit constipation,STC)是一種以結(jié)腸通過時(shí)間延長(zhǎng)和結(jié)腸動(dòng)力下降為特征的頑固性便秘,是慢性便秘中常見的類型，好發(fā)于兒童、婦女和老人，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還給家庭及社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣以及精神心理等因素的影響，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，而臨床對(duì)STC的治療一直不能取得滿意療效，目前患者對(duì)慢性便秘治療的滿意度低于50%[3-4]。STC治療困難的主要原因是其發(fā)病原因不明，發(fā)病機(jī)制尚不確切。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cell of Cajal,ICC)是腸神經(jīng)系統(tǒng)的一種具有獨(dú)立功能的特殊類型的細(xì)胞,以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在于胃腸道[5]。由于其在控制胃腸動(dòng)力方面獨(dú)特和重要的地位,已逐漸成為胃腸動(dòng)力領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。近年來研究[6-7]表明，ICC的數(shù)量減少、分布、結(jié)構(gòu)及功能異常，是STC的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素。白術(shù)是傳統(tǒng)的補(bǔ)氣藥，有健脾燥濕之功，常用于脾虛泄瀉，較少專用于通便。而單用大劑量生白術(shù)則可治療慢性便秘，近10年來驗(yàn)之臨床，療效頗佳[8-9]。不同劑量白術(shù)為何有不同的臨床療效，其作用機(jī)制如何，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以揭示。本實(shí)驗(yàn)采用胃殘留率及黑色炭末推進(jìn)率測(cè)定以檢測(cè)大鼠的腸道傳輸功能，研究不同劑量生白術(shù)對(duì)STC大鼠胃腸道傳輸功能的影響；并采用免疫組化法，觀察白術(shù)對(duì)STC大鼠胃竇、小腸、結(jié)腸組織ICC細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)的影響,以期探討不同劑量生白術(shù)對(duì)STC的作用機(jī)制。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康Wistar大鼠40只，清潔級(jí)，均為雄性，周齡4～5周，體質(zhì)量50～80 g，由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004。

1.2主要試劑大黃酸粉(南京澤朗醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào):ZL20130310A)；生理鹽水(湖南康源制藥有限公司)。粉末活性炭(分析純)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；生白術(shù)水煎劑：生白術(shù)飲片(北京同仁堂藥店)，將生白術(shù)用蒸餾水浸泡12 h后高火煎煮20 min, 倒出煎液，12層紗布過濾，重復(fù)2次，合并3次濾液，濃縮為1.75、7.0 g/mL藥液，按生白術(shù)臨床治療便秘大劑量60 g/d，常規(guī)劑量15 g/d，換算配制水提物溶液。營(yíng)養(yǎng)性半固體糊的制備[10-11]： 取10 g羧甲基纖維素鈉，溶于250 mL蒸餾水中，分別加入16 g奶粉，8 g糖,8 g淀粉和2 g活性炭末,攪拌均勻，配制成300 mL約300 g的黑色半固體糊狀物，冰箱冷藏,用時(shí)恢復(fù)至室溫。制備后營(yíng)養(yǎng)性半固體糊密度為1 g /mL。

1.3主要儀器Termo烤片儀(英國(guó))；RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；RM2145組織切片機(jī)(美國(guó)Leica公司)；DH3600 A電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限有限公司) ECLIPSE801生物顯微鏡(日本Nikon公司)；數(shù)碼相機(jī)(日本Olympus公司)；ANTI-MOULD型顯微鏡攝像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。4 ℃冰箱(美菱冰箱廠)；微量可移液器(美國(guó)Gilson公司)；c-kit兔抗鼠多克隆抗體(美國(guó) Santa Cruz公司)；兔/鼠兩步法試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

2方法

2.1STC大鼠模型制備參照張波等[12]的造模方法,采用大黃酸粉懸液灌胃法建立STC大鼠模型。大鼠分籠飼養(yǎng)，保持適宜的環(huán)境，飼養(yǎng)7 d后開始建立模型。對(duì)照組給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃。各治療組、模型組給予大黃酸粉懸液灌胃，造模過程分3個(gè)循環(huán)完成。第1循環(huán)約35 d，給藥劑量為240 mg/(kg·d)，灌2 d停1 d，灌胃第2天半數(shù)大鼠出現(xiàn)稀便，維持此劑量至80%大鼠稀便消失后開始下一循環(huán)；第2循環(huán)約35 d，給藥劑量同上，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失；第3循環(huán)約45 d，給藥劑量為320 mg/(kg·d)，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失；3個(gè)循環(huán)共約115 d。

2.2動(dòng)物分組及處理按照完全隨機(jī)的方法，將40只大鼠完全隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組，每組10只，分組后各組體質(zhì)量無顯著性差異。模型建立后，空白對(duì)照組、模型組給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃。常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組分別給予生白術(shù)水煎劑，1.75、7.0 g/(kg·d)給大鼠灌胃[3-4]，2次/d，共14 d，每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤，活動(dòng)范圍，進(jìn)食、飲水量及大便性狀。整個(gè)過程結(jié)束普通干飼料飼養(yǎng)待處理。

2.3觀察指標(biāo)及方法

2.3.1胃殘留率及黑色炭末推進(jìn)率測(cè)定治療結(jié)束7 d后大鼠禁食，不禁水24 h，各組大鼠經(jīng)口灌入營(yíng)養(yǎng)性半固體糊2 mL，40 min后以頸椎脫臼法處死，立即剖腹，結(jié)扎幽門與賁門和直腸末端，取出全胃，幽門至直腸末段的全部腸管，清洗胃表面，測(cè)得胃總重(W1)后，沿胃大彎剖開，洗去胃內(nèi)容物，用濾紙吸干水分測(cè)得胃凈重(W2)，并計(jì)算胃殘留率。無張力情況下測(cè)量腸道全長(zhǎng)(L1)及黑色營(yíng)養(yǎng)性半固體糊在腸道內(nèi)推進(jìn)的長(zhǎng)度(L2)，并計(jì)算黑色炭末推進(jìn)長(zhǎng)度占腸道全長(zhǎng)的百分比，最后計(jì)算每組的平均值。胃殘留率(%)=(W1-W2)/糊重×100%。黑色炭末推進(jìn)率(%)=(L2/ L1)×100%。

2.3.2標(biāo)本采集胃稱重后，留取胃竇部胃壁全層，約0.5 cm×0.5 cm大小。同時(shí)十二指腸遠(yuǎn)端、結(jié)腸(直、乙狀結(jié)腸)各留取長(zhǎng)約1 cm的腸管組織，縱行剖開，生理鹽水沖洗，分別固定于多聚甲醛溶液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

2.3.3HE染色片制備和觀察石蠟切片后常規(guī)脫蠟脫水，蘇木素染色液中染色5 min，自來水洗，溫水藍(lán)化，自來水沖洗，伊紅染色液染色2 min，80%乙醇適當(dāng)分化，95%、無水乙醇分別脫水2次，二甲苯透明1 min，中性樹膠封片。

2.3.4免疫組化染色石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟脫水，PBS沖洗，抗原修復(fù)(采用高溫高壓修復(fù)時(shí)間為100 s)，PBS沖洗，過氧化氫溶液37 ℃孵育10 min，PBS沖洗，滴加適量一抗(1∶00)在37 ℃濕盒內(nèi)孵育60 min，PBS沖洗，滴加二抗，室溫下孵育40 min，水洗，PBS沖洗，滴加DAB顯色液，清水沖洗，蘇木精染色，中性樹膠封片。

3結(jié)果

3.1一般情況造模時(shí)間為115 d，造模后，大鼠出現(xiàn)皮毛發(fā)紅、無光澤，精神萎靡，活動(dòng)量減少，進(jìn)食少，形體消瘦，體質(zhì)量平均下降約20%，飲水量明顯增多。大部分大鼠在飼喂過程中出現(xiàn)血便，半數(shù)大鼠出現(xiàn)血尿，3只大鼠在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)脫肛。經(jīng)生白術(shù)灌胃后，大鼠上述情況有所好轉(zhuǎn)。

3.2各組大鼠胃殘留率比較見表1。

組 別胃殘留量/g胃殘留率/%空白對(duì)照組 0.73±0.1936.30±9.57 模型組 1.47±0.2272.74±8.94#常規(guī)劑量白術(shù)組0.84±0.1841.75±9.16△大劑量白術(shù)組 0.91±0.1945.65±9.31△

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0．05，與模型組比較△P<0．05

3.3各組大鼠黑色炭末推進(jìn)率比較見表2。

組 別腸道全長(zhǎng)/cm黑色炭末推進(jìn)長(zhǎng)度/cm黑色炭末推進(jìn)率/%空白對(duì)照組 133.07±6.2782.35±6.5861.84±3.05 模型組 135.66±4.3353.23±6.6339.24±4.28# 常規(guī)劑量白術(shù)組132.07±7.6469.51±8.0052.13±4.37△ 大劑量生白術(shù)組135.62±5.8576.90±6.5656.76±5.16△▲

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0．05，與模型組比較，△P<0．05，與常規(guī)劑量白術(shù)組比較，▲P<0．05

3.4胃腸道大體形態(tài)和蘇木精-伊紅染色觀察模型組大鼠胃黏膜層略薄于空白對(duì)照組，治療后2組胃黏膜層均有所改善。模型組大鼠小腸黏膜層絨毛與空白對(duì)照組相比明顯變短、減少，經(jīng)常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組治療后，大鼠小腸絨毛形態(tài)有所改善，而大劑量生白術(shù)較常規(guī)劑量生白術(shù)效果更明顯。模型組大鼠小腸黏膜層可見少量淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，偶有上皮細(xì)胞脫落，但未見明顯潰瘍。結(jié)腸可見慢性炎癥，全層均有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，以固有層為主，但未見明顯的潰瘍。經(jīng)常規(guī)劑量生白術(shù)組、大劑量生白術(shù)組治療后，小腸、結(jié)腸黏膜層炎細(xì)胞均有減少。模型組大鼠結(jié)腸較空白對(duì)照組粗大、迂曲，腸腔內(nèi)可見大塊糞便存留。經(jīng)常規(guī)劑量及大劑量生白術(shù)治療后，結(jié)腸腸腔內(nèi)均未見大塊糞便存留，而大劑量白術(shù)組效果更為明顯。

3.5各組大鼠胃腸道中c-kit陽性細(xì)胞分布變化比較見表3。

組 別胃小腸結(jié)腸空白對(duì)照組 35882.00±6519.1042780.43±3819.76 44169.71±5353.43 模型組 33631.57±4473.5318683.86±3431.47#16305.86±5454.73# 常規(guī)劑量白術(shù)組34035.82±2729.0720542.19±5218.42 25416.57±4621.28△ 大劑量生白術(shù)組33998.26±4375.3121067.81±5265.07 32980.11±4019.01△▲

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0．05;與模型組比較，△P<0．05;與常規(guī)劑量白術(shù)組比較，▲P<0．05

4討論

白術(shù)性溫，歸脾、胃經(jīng)，其功能主要在于健脾益氣，燥濕利水，用于脾虛食少，腹脹泄瀉。臨床較少專用之治療便秘。1978年北京醫(yī)院的魏龍?bào)E[13]先生首先介紹了重用生白術(shù)治便秘的臨床經(jīng)驗(yàn)，之后的30余年來，大劑量生白術(shù)治療便秘已在臨床廣泛使用,且療效肯定。但對(duì)不同劑量白術(shù)治療便秘的作用機(jī)制有何不同，其量效關(guān)系如何，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究還較少。

臨床上慢傳輸型便秘患者除便秘之外，往往還有脾虛氣虧之表現(xiàn)，如腹脹、納差、乏力等。根據(jù)慢傳輸型便秘的臨床表現(xiàn)，筆者認(rèn)為其可歸屬于中醫(yī)虛秘、氣秘范疇。腸道傳輸緩慢即脾胃運(yùn)化傳輸能力減弱，故其病位雖在大腸，但與脾虛氣虧有著密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)顯示STC大鼠在黑色炭末推進(jìn)率明顯降低的同時(shí)，其胃殘留率明顯增加，經(jīng)常規(guī)劑量及大劑量白術(shù)治療后胃殘留率均有所下降，而二者之間無顯著差異。對(duì)于黑色炭末推進(jìn)率的降低，小腸黏膜層絨毛的改善、結(jié)腸腸腔內(nèi)糞塊的排出以及結(jié)腸c-kit陽性細(xì)胞的面積增加等方面，大劑量生白術(shù)的療效均明顯優(yōu)于常規(guī)劑量生白術(shù)。說明生白術(shù)常規(guī)劑量及大劑量均可以促進(jìn)STC大鼠的胃動(dòng)力，而在改善STC大鼠腸道傳輸功能及增加c-kit陽性細(xì)胞面積方面則以大劑量白術(shù)效果為佳。

作為胃腸道的起搏細(xì)胞,Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)在控制胃腸道運(yùn)動(dòng)中起重要作用，目前公認(rèn)其在結(jié)腸中的數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常與STC發(fā)病有密切的關(guān)系。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的標(biāo)記方法有多種，而特異性最強(qiáng)的是c-kit。c-kit信號(hào)在維持ICC的發(fā)育、發(fā)展、功能方面具有重要作用，去除大鼠小腸c-kit基因后，ICC將不能產(chǎn)生慢波，從而導(dǎo)致胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂[14]，因此現(xiàn)在常用c-kit免疫組織化學(xué)法特異性地檢測(cè)ICC[15]，利用c-kit免疫組織化學(xué)法可在光鏡水平觀察ICC形態(tài)、數(shù)量和分布特點(diǎn)[16]。本實(shí)驗(yàn)表明STC大鼠胃竇、小腸、結(jié)腸c-kit陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯變化，其胃竇肌層c-kit陽性細(xì)胞面積也無明顯變化，而STC大鼠小腸、結(jié)腸組織c-kit陽性細(xì)胞的面積則明顯降低，其更深層次的機(jī)制，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以闡明。

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AtractylodesmacrocephalaKoidzon gastrointestinal trace and ICC in rat with slow transit constipation

WANG Wenge1,CI Miaomiao1,ZHANG Junhong1,LIU Xing2

(1.Department of Pediatrics,Air Force General Hospital of People’s Liberation Army,Beijing 100142,China;2.Department of Pediatrics,Hongxing Hospital of Daxing District,Beijing 100076,China)

Abstract：Objective To observe the influence of Atractylodes macrocephala Koidz on gastrointestinal trace and ICC in rat with slow transit constipation.MethodsThe 40 Wistar rats were randomly divided into blank control group,model group,Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose group,Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group.The blank control and model group were given normal saline by gavage,the rest of the groups were given drug treatment accordingly.After 14 days,gastric motility and transit functions of intestinal movement were examined by administering intragastricly of semi-solid nutrition paste.The ICC changes in terms of the number and volume were observed by immunohistochemical method.ResultsAtractylodes macrocephala Koidz treatment group compared with model group can significantly reduce the gastric residual rate ( P< 0．05),but there was no significant difference with each other(P>0．05).Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose and high-dose group can increase the carbon black transit rate (P< 0．05),and Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group were significantly higher than in the Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose t group( P< 0．05).After treatment by Atractylodes macrocephala Koidz, the volume of c-kit positive cell in colon were increased(P< 0．05),and Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group was more larger than the Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose group(P< 0．05).ConclusionThe Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose and high-dose group can promote the gastrointestinal motility,Atractylodes macrocephala Koidz of high-dose has the better effect on transit function of intestinal movement and the volume recovery of ICC in colon.

Keywords：Atractylodes macrocephala Koidz;slow transit constipation;gastrointestinal motility;interstitial cell of Cajal

(收稿日期:2015-06-11)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)01-0018-04

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡(jiǎn)介:王文革(1966-)，女，博士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合兒科疾病研究。

基金項(xiàng)目:北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(7122180)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.006