楊曉旭，王　宇，韓貞愛，薛　迪，劉樹民

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

淫羊藿水煎液對(duì)小鼠不同免疫水平模型的干預(yù)作用

楊曉旭，王宇，韓貞愛，薛迪，劉樹民*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

摘要：目的通過構(gòu)建3個(gè)小鼠免疫系統(tǒng)模型，研究淫羊藿水煎液(WDE)對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的綜合作用關(guān)系，從而為淫羊藿臨床治療免疫系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。方法通過構(gòu)建小鼠遲發(fā)型特異性超敏反應(yīng)(DTH)模型、以碳粒廓清法檢測(cè)的正常小鼠和非特異性免疫低下小鼠模型、刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)的體外小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖3種模型,考察淫羊藿對(duì)不同水平免疫模型的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果WDE能夠有效降低超敏反應(yīng)下的脾系數(shù)和炎癥因子IL-2、IL-4水平(P<0．01)；碳粒廓清法中，給藥組與空白組相比WDE可使正常生理狀態(tài)下小鼠的脾系數(shù)和廓清指數(shù)明顯降低(P<0.05)，而同樣給予環(huán)磷酰胺的模型給藥組與模型組相比WDE可使免疫低下小鼠的脾系數(shù)、胸腺系數(shù)、廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)均明顯升高(P<0.05)；此外，WDE能顯著抑制ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P<0．01)，且其作用強(qiáng)度呈劑量依賴性。結(jié)論WDE對(duì)DTH小鼠和正常小鼠均有免疫抑制作用，體外亦能抑制脾淋巴細(xì)胞的增殖，并且對(duì)免疫低下小鼠有顯著的免疫增強(qiáng)和保護(hù)作用，淫羊藿水煎液可能對(duì)免疫系統(tǒng)有雙向調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：淫羊藿水煎液；免疫系統(tǒng)；調(diào)節(jié)作用

淫羊藿(epimedii folium)為小檗科植物，別名淫羊藿，味辛、甘，性溫，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕功效，是傳統(tǒng)的補(bǔ)虛壯陽中藥材?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[1-2]表明，淫羊藿具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)雄性生殖功能、抗骨質(zhì)疏松、抗炎抗病毒抗氧化、改善心血管系統(tǒng)病變和促進(jìn)骨髓造血系統(tǒng)功能等作用。近年來，大量實(shí)驗(yàn)研究[3-4]表明，淫羊藿及其提取物對(duì)機(jī)體免疫功能有顯著增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用，但以往研究針對(duì)的模型過于單一，綜合性分析不強(qiáng)。本研究通過建立小鼠多個(gè)免疫功能評(píng)價(jià)模型，分析淫羊藿水煎液作用下各個(gè)模型的指標(biāo)變化，從正常生理狀態(tài)、超敏反應(yīng)病理狀態(tài)和免疫低下病理狀態(tài)總結(jié)其對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)作用的綜合性研究，從而為中藥臨床治療免疫系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。

1材料

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃，8:00 am到8:00 pm人工燈光照明，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1．2藥材與試劑淫羊藿藥材購(gòu)自世一堂中藥材有限公司，批號(hào)130916，產(chǎn)地黑龍江。PBS磷酸鹽緩沖液(北京博奧拓達(dá)科技有限公司，140703)，刀豆蛋白(sigma:C-2010)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，NZD1134)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,140520)，青霉素鏈霉素混合液(北京博奧拓達(dá)科技有限公司，20140512)，MTT(sigma:M2128)，二甲基亞砜(天津凱通化學(xué)試劑有限公司,20140510)，2，4-二硝基氟苯(成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司，D16877)，橄欖油(歐麗薇蘭，20140331)，丙酮(天津市化學(xué)試劑六廠三分廠,20110620)，印度墨汁(北京博奧拓達(dá)科技有限公司，20130718)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,13121825)。

1．3實(shí)驗(yàn)儀器AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，DL-CJ-1ND醫(yī)用型治凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，MK3酶標(biāo)儀(Thermo)，CO2孵育箱(Heal Force,HF90),TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，UVmini-1240型紫外分光光度計(jì)(日本島津)。

2方法與結(jié)果

2．1淫羊藿水煎液對(duì)DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型特異性超敏反應(yīng)(DTH)的影響

2．1．1動(dòng)物分組、造模及給藥量取體質(zhì)量18～22 g昆明小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、模型組和給藥組，每組10只，模型和給藥組小鼠腹部皮膚去毛約1 cm ×2 cm區(qū)域，然后用微量移液器取1%DNFB(溶于橄欖油∶丙酮=1∶1中)50 μL，均勻滴加于脫毛區(qū)致敏，并且于致敏當(dāng)天開始，給予淫羊藿水煎液208 mg/kg(按2010藥典中臨床生藥量10 g/d計(jì)算)，給藥體積為0．1 mL/10 g，空白組給同體積生理鹽水，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，用微量移液器取10 μL的1%DNFB，均勻滴加于小鼠右耳前后兩面觸發(fā)，造成DTH模型。

2．1．2取材與測(cè)定指標(biāo) 末次給藥24 h后稱體質(zhì)量，脫頸椎致死，稱量脾臟和胸腺的重量，脾指數(shù)=脾重×10/體質(zhì)量；胸腺指數(shù)=胸腺重×10/體質(zhì)量。分別剪下雙耳，用8 mm打孔器在相同部位打下圓耳片，電子天平稱重，以左、右耳片重量差值作為腫脹度；摘眼球取血，靜置2 h后低溫離心制備血清，elisa法測(cè)定血清中的IL-2和IL-4的含量。

抑制率=對(duì)照組平均腫脹度—給藥組平均腫脹度/對(duì)照組平均腫脹度×100%

2．1．3淫羊藿水煎液對(duì)DNFB所致DTH的影響結(jié)果見表1。

2．2淫羊藿水煎液分別對(duì)正常小鼠和免疫低下小鼠非特異性單核細(xì)胞吞噬作用及免疫器官的影響(碳粒廓清法)

2．2．1動(dòng)物分組、造模與給藥量取體質(zhì)量18～22 g昆明小鼠40只，隨機(jī)分為空白組、模型組、給藥組和模型給藥組，雌雄各半。給藥組每天給予淫羊藿水煎液208 mg/kg，給藥體積為0．1 mL/10g，連續(xù)給藥10 d，空白組和模型組給同體積生理鹽水。模型組和模型給藥組于第7～10天，每天灌胃30 min后皮下注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，1次/d，注射體積為0．1 mL/10 g。

±s，n=10)

注：與空白組比較，##P<0．01，與模型組比較，△△P<0．01

2．2．2單核細(xì)胞吞噬功能的考察[5-6]末次給藥后24 h，按0．1 mL/10 g尾靜脈注射稀釋的印度墨汁(1%明膠稀釋4倍)，于注入墨汁后2、6 min分別從眼靜脈叢取血20 μL，立即加入裝有2 mL的0．1% Na2CO3的試管中，以0．1% Na2CO3溶液做空白對(duì)照，于600 nm下測(cè)定OD值，帶入下列公式計(jì)算廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，并且脫臼處死后取脾臟和胸腺稱重，按2．1．2中方法測(cè)脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

廓清指數(shù)：k=(lgOD1—lgOD2)/(T2—T1)；

吞噬指數(shù)：α=K1/3×(體質(zhì)量/肝重+脾重)

2．2．3淫羊藿水煎液分別對(duì)正常小鼠和免疫低下小鼠單核細(xì)胞吞噬作用及免疫器官的影響結(jié)果見表2。

±s，n=10)

注：與空白組比較，#P<0．05，##P<0．01；與模型組比較，△P<0．05

2．3淫羊藿水煎液對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠體外脾細(xì)胞增值的影響

2．3．1小鼠脾淋巴細(xì)胞制備將1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素液按90∶10∶1比例混合，制成培養(yǎng)基混合液。取健康昆明雄性小鼠1只，禁食禁水12 h后處死，于超凈工作臺(tái)中解剖，取脾臟放入平皿中用PBS清洗后，轉(zhuǎn)移至100目不銹鋼篩網(wǎng)上，用無菌注射器芯擠壓研磨脾組織，并用PBS輕輕沖洗鋼網(wǎng)，制成脾細(xì)胞懸液，分裝在兩只10 mL的離心管中，離心后去上清液，分別裝入8 mL的PBS，用移液槍吹打沖洗管壁，再離心去上清液，重復(fù)2次后加入培養(yǎng)基混合液反復(fù)吹打管壁，配成6×106個(gè)/ mL的均勻細(xì)胞懸液。

2．3．2給藥濃度確定及細(xì)胞毒作用考察在96孔板中，每孔加100 μL的2．4．1中的細(xì)胞懸液，設(shè)空白孔、模型孔、各濃度給藥孔，藥粉加培養(yǎng)基溶解過膜后配制成8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．062 5 mg/mL。

2．3．3接種細(xì)胞在96孔板中，每孔加100 μL的2．3．1項(xiàng)下的細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、各劑量給藥組，每組平行三復(fù)組，除空白組外其他各組均加入20 μL濃度為35 mg/mL的ConA，低、中、高給藥組分別加入濃度為0．25、0．5、1 mg/mL的過膜后的淫羊藿水煎液各20 μL，空白組和模型組分別補(bǔ)充培養(yǎng)基混合液至等體積。將96孔板置于37 ℃的CO2孵箱，飽和濕度下培養(yǎng)44 h后，各孔避光加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后2 000 r/min離心，棄上清，加入DMSO溶解液150 μL，30 min后在492 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值，小鼠脾淋巴細(xì)胞存活率=樣品孔均值/(空白孔均值×100%)。

2．3．4淫羊藿水煎液對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠體外脾淋巴細(xì)胞增值的影響結(jié)果見表3。

組 別吸光度值存活率/%空白組0.761±0.026 100模型組1.054±0.024##138.458給藥0.25mg/mL組0.817±0.032△△115.725給藥0.5mg/mL組0.730±0.037△△102.102給藥1mg/mL組0.587±0.035△△93.955

注：與空白組比較，##P<0．01，與模型組比較，△△P<0．01

3討論

免疫器官是免疫細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的場(chǎng)所，免疫器官的增大與減小很大程度上反映了機(jī)體的免疫功能。采用2,4-二硝基氟苯造成非特異性遲發(fā)型超敏變態(tài)反應(yīng)模型，造模劑量適中，存活率高，以免疫器官指數(shù)為考察指標(biāo)，模型組與空白組差異明顯，結(jié)果表明淫羊藿水煎液對(duì)超敏所致的脾指數(shù)增加、耳腫脹，血清中炎癥因子IL-2、IL-4含量升高均有顯著的回調(diào)作用，提示淫羊藿水煎液對(duì)超敏反應(yīng)的顯著抑制作用可能是通過改變細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。

廓清指數(shù)是血流中異物被巨噬細(xì)胞清除的速率，其廓清指數(shù)越大，碳粒廓清能力越強(qiáng)，而碳粒廓清能力又反應(yīng)單核細(xì)胞的吞噬能力，單核細(xì)胞的吞噬能力是反映其免疫功能的主要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)以碳粒廓清法分別考察WDE對(duì)正常小鼠和環(huán)磷酰胺(CY)造成的免疫低下小鼠的免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，CY是較強(qiáng)的烷化劑，可殺傷各種免疫細(xì)胞，抑制免疫功能，為免疫學(xué)研究中常用造模劑。結(jié)果表明淫羊藿水煎液對(duì)免疫低下小鼠脾臟萎縮有明顯的拮抗作用，并可促進(jìn)單核細(xì)胞吞噬功能，在這相同廓清法下，淫羊藿水煎液對(duì)正常小鼠的脾系數(shù)有下調(diào)現(xiàn)象，并對(duì)單核細(xì)胞廓清指數(shù)有明顯的降低，這種現(xiàn)象可能是由于淫羊藿在生物免疫應(yīng)答上存在多水平，多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)功能，其在此模型下表現(xiàn)出來的上調(diào)或下調(diào)免疫水平的結(jié)果，更有力地提示其對(duì)免疫系統(tǒng)存在雙向調(diào)節(jié)作用。

脾淋巴細(xì)胞是重要的免疫活性細(xì)胞，它能被有絲分裂原ConA所激活向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化過程中DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成增加使細(xì)胞分裂增殖[7]，采用MTT法考察脾淋巴細(xì)胞的增殖程度，可反映機(jī)體細(xì)胞的免疫功能。Colic M等[8]研究證實(shí)，淫羊藿可使之前在體內(nèi)活化了的淋巴細(xì)胞在體外卻表現(xiàn)出免疫抑制活性，這也證明了本實(shí)驗(yàn)中，高、中劑量淫羊藿水煎液使體外脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖能力明顯下降這一結(jié)果。

在中藥臨床治療中發(fā)現(xiàn)，許多中藥在病理狀態(tài)下有很好的療效，但對(duì)正常生理狀態(tài)條件下所起作用并不明顯，這是由于病理狀態(tài)下的藥物吸收速度、吸收部位、轉(zhuǎn)化后血藥濃度與正常生理狀態(tài)有很大不同，機(jī)體代謝和應(yīng)激通路反應(yīng)等亦存在很大差異。因此構(gòu)建成功的更接近臨床應(yīng)用實(shí)際情況的病理模型，無疑具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過遲發(fā)性特異性超敏模型、碳粒廓清法非特異性模型、體外脾淋巴細(xì)胞增殖3種模型綜合研究淫羊藿水煎液對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響,造模方法成熟,結(jié)果差異明顯。研究中不僅成功地造成超敏反應(yīng)和免疫抑制2種病理狀態(tài)，而且在碳粒廓清法中分別考察了淫羊藿水煎液對(duì)正常小鼠和免疫低下小鼠單核細(xì)胞吞噬能力，證明了在正常生理狀態(tài)下淫羊藿水煎液是沒有起到免疫增強(qiáng)作用，甚至出現(xiàn)了抑制，但其對(duì)正常機(jī)體的免疫保護(hù)作用是通過拮抗CY誘導(dǎo)的免疫功能下降來體現(xiàn)的,可以用于臨床上化療藥物等易引起免疫功能低下疾病的防治；此外，淫羊藿水煎液對(duì)超敏反應(yīng)小鼠和脾淋巴細(xì)胞惡性增殖均有很好的免疫回調(diào)和保護(hù)作用，不僅對(duì)超敏反應(yīng)下的小鼠免疫器官、耳腫脹，IL-2、IL-4水平有明顯的抑制作用，并且對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖有明顯的拮抗作用。綜合分析各模型后不難發(fā)現(xiàn)，淫羊藿水煎液對(duì)正常小鼠有輕微免疫抑制作用，對(duì)超敏反應(yīng)小鼠有顯著的免疫抑制作用，并對(duì)免疫低下小鼠有顯著的免疫增強(qiáng)作用，說明淫羊藿水煎液可能對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，但其影響機(jī)制的分子學(xué)基礎(chǔ)尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步對(duì)淫羊藿及其提取物進(jìn)行生物免疫應(yīng)答方向的研究。

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Interventional effect of water decoction of Epimedium on immune system model of mice at different levels

YANG Xiaoxu,WANG Yu,HAN Zhenai,XUE Di,LIU Shumin*

(Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Abstract：ObjectiveStudy the comprehensive effect of water decoction of Epimedium(WDE) on immune system of mice by constrcting three immune system model.This study provides the theory basis of clinical treatment for immune system diseases by using traditional Chinese medicine.MethodsThe author investigated the effect of WDE on different immune model by establishing three models.There are delayed type hypersensitivity (DTH) model,normal mice and immunocompromised mice model model evaluated by carbon clearance method,and multiplication of splenic lymphocyte model induced by ConA.ResultsThe coefficient of spleen,IL-2 and IL-4 of hypersensitivity decreased significantly(P<0．01) after giving WDE.Detecting by Carbon clearance method,WDE decreased coefficient of spleen,expurgation index,phagocytic count of normal mice compared with blank group(P<0.05).However,the WDE significant increased coefficient of spleen,expurgation index,phagocytic count of immunocompromised mice compared with model group(P<0.05)which were both given Cy.In addition,WDE can significantly inhibit the spleen lymphocyte proliferation reaction induced by ConA,and its strength are dose dependent.ConclusionThe WDE has the effect of immunosuppression on DTH in mice and normal mice ,and on restrain the malignant proliferation of spleen lymphocytes in vitro,and on enhancing and protecting the immune system in immunocompromised mice obviously.So,the WDE could have two-way adjustment function of the immune system.

Keywords：water decoction of Epimedium(WDE);immune system;regulating effect

(收稿日期:2015-06-11)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)01-0014-04

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*通信作者：劉樹民，教授，博士研究生導(dǎo)師，電話-(0451)82193278，電子信箱-kji-liu@163.com

作者簡(jiǎn)介：楊曉旭(1987-)，女，博士研究生，主要從事中藥性味理論研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)課題(2013CB531804)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.005