郭　蕊，王殿永，項　方，宋立仁（.河北省昌黎縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北昌黎066600；.昌黎縣家畜繁育改良站，河北昌黎066600）

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副豬嗜血桿菌病細菌分離及PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

郭蕊1，王殿永1，項方1，宋立仁2
（1.河北省昌黎縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北昌黎066600；2.昌黎縣家畜繁育改良站，河北昌黎066600）

本病又稱為革拉斯病（GlsserDisease），是由副豬嗜血桿菌引起豬的又一種新的細菌性傳染病，以多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟失調(diào)和被毛粗亂、胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。也可引起母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。該病目前呈世界性分布，在我國的發(fā)病也呈上升的趨勢，造成的經(jīng)濟損失日益嚴(yán)重，但豬副嗜血桿菌病與豬鏈球菌病、豬傳染性胸膜肺炎等可引起呼吸系統(tǒng)的疾病不易區(qū)分，且混感率較高，為該病的診斷帶來一定的困難。

副豬嗜血桿菌為革蘭氏染色陰性，有莢膜，具有多種不同的形態(tài)。該菌生長時嚴(yán)格需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子）。流行菌株在TSA平板的菌落呈針尖大小、灰白色、透明。本菌至少有15種血清型，另有大量分離株血清型不可定型，目前在我國的主要流行菌株是4、5、14和15型等，且不同地區(qū)不同分離菌株致病力差異較大。14～120日齡的豬均易感，但通常見于5～8周齡的豬發(fā)病。發(fā)病率10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達50%～60%。

因此為了保證診斷的準(zhǔn)確性，在最短的時間內(nèi)對豬群進行處理，繼而降低經(jīng)濟損失，我們采取細菌分離與PCR結(jié)合的方法來對其進行研究。

1　材料

1.1實驗動物

某發(fā)病豬場的病豬及送檢病、死豬。

1.2臨床癥狀

發(fā)熱、食欲不振、厭食、反應(yīng)遲鈍、呼吸困難、咳嗽、疼痛（尖叫）、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、顫抖、共濟失調(diào)、可視黏膜發(fā)紺、側(cè)臥，消瘦和被毛凌亂，隨之可能死亡。急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。肉眼病變主要是全身性漿液性、化膿性、纖維素性炎癥，包括心、肺、肝等內(nèi)臟器官、腹膜、心包膜、胸膜、及其關(guān)節(jié)表面（圖3～6）等，尤其是腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)，出現(xiàn)漿液性和化膿性纖維蛋白滲出物。診斷本病時應(yīng)注意與鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支原體多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎等相區(qū)別，本病確診有賴于細菌學(xué)以及分子生物學(xué)檢查。

2　細菌學(xué)檢測

2.1主要試劑與儀器

牛血清、TSA、輔酶I（煙酞胺腺嘌呤二核苷酸NAD）、培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱、電子秤、搖床、高速冷凍離心機等。

TSA固體培養(yǎng)基:準(zhǔn)確稱取胰蛋白大豆瓊脂（TSA）40g，加入940mL蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，高壓蒸汽滅菌15min，加入50mL過濾除菌的牛血清、10mL過濾除菌的0.01%NAD，充分搖勻后倒平皿。

2.2實驗方法

無菌采集胸膜、胸腹腔積水、心包積液、關(guān)節(jié)液等病料，分別接種于自制的TSA固體培養(yǎng)基平板，置于5%～10%CO2中培養(yǎng)，37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48h后，檢查其在培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)、菌落特征等培養(yǎng)特性，結(jié)果顯示菌株在TSA平板的菌落呈針尖大小、灰白色、透明（圖1），然后純培養(yǎng)與鑒定。

對培育菌株進行革蘭氏染色以及培養(yǎng)后接種于脈酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微型生化鑒定管等進行生化指標(biāo)的測定，37℃培養(yǎng)，24～48h后觀察現(xiàn)象。革蘭氏染色陰性，多種不同的形態(tài)的小桿菌（圖2）。

將培育菌株劃線接種于鮮血瓊脂平皿，用紙片法將20種藥物進行藥敏試驗，37℃胚培養(yǎng)24～36h，觀察結(jié)果顯示：本菌對頭孢類抗生素、氨芐西林、氟喹諾酮類，但對紅霉素、氨基甙類、壯觀霉素和林可霉素有抗藥性。

3　PCR檢測

3.1主要試劑與儀器

電泳緩沖液TAE、PBS、DNAmarker、EB、各種型號移液器及滴頭、氯仿以及其他分析純等。

PCR儀、電泳儀、電子天平、超凈工作臺、水浴鍋、高速低溫離心機、高壓滅菌鍋等。

3.2實驗步驟

將被檢菌液12000r/min離心5min，棄上清液，用無菌水懸浮，渦旋后于沸水中水浴10min后，再放置-20℃凍結(jié)，然后12000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板。根據(jù)副豬嗜血桿菌序列設(shè)計引物，由上海生某公司合成。

（1）采用50μL反應(yīng)體系：上下游引物1.5μL，2.5mmoldNTPs4.0μL，Exbuffer5.0μL，ExTaq酶0.5μL，模板DNA8.0μL、滅菌雙蒸水30μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共30循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增片段的大小。

（2）1%瓊脂糖凝膠的配制：稱取3g瓊脂糖，加入300mLlxTAE溶液，微波爐加熱至完全溶解。稍微冷卻，加入溴化乙錠（EB至終濃度為5μg/mL），趁熱倒入制膠槽，高度約0.5cm，自然凝固后，小心拔出梳子，將平板放入電泳槽中，加樣孔一端朝向陰極。電泳槽內(nèi)倒入足夠的1XTAE溶液，使之正好沒過制好的瓊脂面。

（3）加樣：PCR產(chǎn)物15μL與3μL6X加樣緩沖液混合均勻，用微量進樣器吸取混合液，Tip頭伸入液面以下，對準(zhǔn)加樣孔，緩慢推出使樣品垂直落入加樣孔內(nèi)。電泳:蓋上電泳槽電泳40～50min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

3.3實驗結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得一約822bp的特異性片段，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)序列測定，其序列與目的基因序列一致。

M：DNAMarker；1：目的基因的擴增產(chǎn)物

4　結(jié)論

4.1近年來，該菌在我國豬群普遍存在（感染率呈明顯的上升趨勢），且臨床癥狀又與鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌等疾病極其相似不易區(qū)分，因此必須通過細菌分離及PCR檢測的方法進行確診，避免因誤診造成不必要的損失。

4.2副豬嗜血桿菌抗藥性日漸增強也已成為不可忽視的問題，疾病發(fā)生的早期，治療或保健性預(yù)防用藥效果明顯，但一定要選擇敏感的抗菌素藥物。大多數(shù)副豬嗜血桿菌對頭孢類抗生素、氟苯尼考、替米考星及喹諾酮類高度敏感，但對一些氨基甙類、壯觀霉素和林可霉素有抵抗力，所以說，對豬場副豬嗜血桿菌進行定期的敏感性藥物監(jiān)測，有利于減少經(jīng)濟損失，保證豬群健康。

4.3接種副豬嗜血桿菌疫苗是預(yù)防該病最有效的方法之一，但不同血清型菌株之間的交叉保護率相對較低，因此，疫苗的使用具有一定的區(qū)域性和局限性，一定要有血清型的針對性才能取得良好的防疫效果。從當(dāng)?shù)胤蛛x的菌株制備滅活苗，可有效控制副豬嗜血桿菌病的發(fā)生。同時做好豬瘟、偽狂犬病、藍耳病、口蹄疫等預(yù)防免疫工作，大大有利于減少本病的發(fā)生。

4.4加強對豬群飼養(yǎng)管理。保證勤打掃，常通風(fēng)，實行嚴(yán)格的定期消毒制度，特別是冬季一定要做好保溫與通風(fēng)的協(xié)調(diào)，盡量減少應(yīng)激。減少或消除其他呼吸道病原，如提前斷奶，減少豬群流動，杜絕豬生產(chǎn)各階段的混養(yǎng)狀況等，并在疫病多發(fā)季節(jié)，在飼料中添加增強體質(zhì)的藥物如：黃芪多糖、電解多維、VC、VE以增強機體抵抗力，減少應(yīng)激，都可有效增強豬體自身免疫力減少本病的發(fā)生。

圖1　副豬嗜血桿菌菌落形態(tài)

圖2　副豬嗜血桿菌形態(tài)

圖3　心包積液，心臟周圍出現(xiàn)纖維素性炎癥

圖4　肺臟包膜

圖5　肺臟粘連

圖6　腹腔出現(xiàn)化濃性炎癥

作者簡介：郭蕊（1978～），獸醫(yī)師

DOI:10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．02.008