張建華

（烏蘭察布市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2基因的克隆表達(dá)及其單克隆抗體的制備方法

張建華

（烏蘭察布市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

研制高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2基因的克隆表達(dá)及其特異性單克隆抗體（Mabs）的制備方法。本研究以HPPRRSV為研究對(duì)象，參照已發(fā)表的PRRSV基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，并在其上下游分別添加BamHI和SalI酶切位點(diǎn)，獲得的PCR產(chǎn)物用BamHI和SalI酶切后與經(jīng)同樣處理的pET-28a原核表達(dá)載體質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞后挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間點(diǎn)后，取細(xì)菌菌體用SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，Nsp2在大腸桿菌中得到表達(dá)。經(jīng)包涵體的提取，用豬抗PRRSV血清抗體進(jìn)行Western-bolt鑒定，結(jié)果表明，融合表達(dá)的pET28adNsp2蛋白能被PRRSV陽(yáng)性血清特異性識(shí)別。取純化的pET28a-Nsp2蛋白按每只100μg的劑量與等量弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，并作為免疫原采取常規(guī)皮下多點(diǎn)注射免疫6-8周齡BALB/c小鼠。取其脾細(xì)胞與SP2/0的骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）篩選，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆。經(jīng)過(guò)3次克隆后獲得了一株抗PRRSV-Nsp2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為A2F1。Western-blot和間接免疫熒光結(jié)果顯示這株單克隆抗體株能與Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與PRRSV CH1A株發(fā)生反應(yīng)，證明獲得的McAb為針對(duì)PRRSV JXA1株的McAb?？贵w亞類鑒定結(jié)果表明，重鏈為IgG1型，輕鏈為κ鏈。采用間接ELISA法測(cè)得單抗的細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)為1：800，腹水效價(jià)分別為1：12800。這株單抗的獲得為進(jìn)一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立準(zhǔn)確快速PRRSV的診斷方法提供了強(qiáng)有力的手段。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1株；Nsp2；單克隆抗體

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是1987年在美國(guó)首先爆發(fā)，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種新發(fā)性傳染病，主要導(dǎo)致母豬繁殖障礙、仔豬的大量死亡，是當(dāng)前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病之一[1]。自2006年開始，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HPPRRS）在我國(guó)的暴發(fā)與流行給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）屬于尼多病毒目，動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬成員，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒；其基因組全長(zhǎng)約為15 kb，含9個(gè)開放式閱讀框（ORFs），其中ORF2-7編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，ORF1編碼的聚合蛋白酶產(chǎn)生12個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1-Nsp12）[2]。在PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白中，Nsp2基因的保守性最差。但Nsp2含有多個(gè)B細(xì)胞表位，且表位集中的區(qū)域親水性較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的免疫原性，病毒感染后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種、毒株、血清、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

pET-28a（+）原核表達(dá)載體；大腸桿菌DH5α、BL21 （DE3）；PRRSV JXA1株和CH1A株；抗PRRSV-NSP2的小鼠陽(yáng)性血清；mark-145細(xì)胞、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞；6～8周齡雌性BALB/c小鼠。

1.1.2 工具酶及主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶（Restriction endonuclease，RE）、T4 DNA連接酶、T4 DNA多聚酶、DNA Marker等工具酶。Taq DNA polymerase（PCR聚合酶）、dNTPs及DNA快速回收試劑盒。

新生小牛血清（超級(jí)）；RPMI-1640、DMEM、次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培養(yǎng)基（HAT）、次黃嘌呤-胸苷培養(yǎng)基（HT）；弗氏完全和弗氏不完全佐劑、二甲基亞楓（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、聚乙二醇4000、HRP辣根過(guò)氧化物酶和FITC；單抗分型試劑盒；淋巴細(xì)胞分離液；羊抗鼠FITC標(biāo)記熒光抗體；其他普通生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 Nsp2基因的克隆與表達(dá)

（1）引物設(shè)計(jì)與合成

從GeneBank獲得PRRSV Nsp2 蛋白的全基因序列，針對(duì)Nsp2基因片段設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增的基因片段為2160bp，由試劑公司合成。

（2）目的片段的擴(kuò)增

在PCR反應(yīng)管中加入1μ LdNTPs（2.5mmol/L）、2μ L MgCl2、上下游引物

（3）原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

BamHI和SalI雙酶切Nsp2并切膠回收目的基因片段，用同樣的酶切位點(diǎn)酶切pET28a原核表達(dá)載體并相連接。連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在LB固體培養(yǎng)基（Amp+）上37 ℃培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化的平皿中挑取一個(gè)單菌落接種于含相應(yīng)抗生素的3 mlLB液體培養(yǎng)基，于37 ℃振蕩培養(yǎng)10～12 h，用試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

（4）蛋白的原核表達(dá)、提取與鑒定

將空白載體和鑒定正確的重組質(zhì)粒同時(shí)分別轉(zhuǎn)化BL 21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化的平皿中挑取一個(gè)單菌落接種于含相應(yīng)抗生素的3 mlLB液體培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)10～12 h；4℃放置過(guò)夜。第二天，將培養(yǎng)物5000 r/min離心5 min，然后用新鮮LB洗滌1次后，用30 mL含相應(yīng)抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基重懸，于37 ℃振蕩培養(yǎng)1～2 h，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h、4 h、5 h、6 h。取1 ml菌液收集于EP管中，5000 r/min離心5 min，棄上清，加100μ l ddH20吹散混勻，加100μ l 2xSDS凝膠加樣緩沖液，混勻后沸水浴5min，于12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)在不同時(shí)間的表達(dá)。

取誘導(dǎo)表達(dá)3 h的細(xì)菌培養(yǎng)物8000 r/min離心10 min，收集細(xì)菌，用10 mM TE（pH 8.0）洗一次，除去殘留培養(yǎng)基成分，再用buffer A重懸，凍融兩次或加入適量的溶菌酶，置37℃溫浴1 h后，加DTT與Triton X-100至終濃度分別達(dá)5 mM與1%，然后進(jìn)行高頻短時(shí)超聲波處理數(shù)次，l0 sec/次（冰上操作），直到液體變?yōu)橥该?。?℃，100000 r/min離心15 min，分別收集上清與沉淀，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定重組蛋白是以可溶形式還是以包涵體形式存在。剩余樣品置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，將重組蛋白所在的包涵體溶解于含20% SKL（十二烷基肌氨酸鈉）的PBS（pH 7.2）中，室溫靜置30 min～2 h。用紫外分光光度計(jì)測(cè)出溶解的蛋白質(zhì)濃度，用PBS稀釋至1 mg/mL，裝入透析袋，內(nèi)加終濃度為0.2%的PEG4000與1 mM氧化型；還原型谷胱甘肽（摩爾比例為1：4）幫助變性的肽鍵依天然構(gòu)象復(fù)性，用大于20倍體積的PBS進(jìn)行4 ℃攪拌透析復(fù)性，每4 h換液一次，換液6次后收集蛋白液，過(guò)濾除菌后分裝置-80℃保存。再經(jīng)Western blot鑒定表達(dá)蛋白的活性。

1.2.2 動(dòng)物免疫

表達(dá)蛋白用PBS緩沖液稀釋到300 μ g/ml，與弗氏完全佐劑等體積充分混勻乳化，選擇雌性6周齡BALB/c小鼠5只，頸背部皮下多點(diǎn)注射0.2 ml。第14 d時(shí)加強(qiáng)免疫1次（佐劑改用弗氏不完全佐劑，免疫劑量和部位同首次免疫）。在第24 d時(shí)尾靜脈采血，分離血清，用間接ELISA法檢測(cè)抗體水平，在第44 d時(shí)對(duì)免疫效果最好的BALB/c小鼠使用不加佐劑的表達(dá)蛋白0.2 ml尾靜脈注射加強(qiáng)免疫一次，3 d后即可融合。

1.2.3 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

用純化后的蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)PGEX-KG表達(dá)產(chǎn)物作為對(duì)照，按常規(guī)間接ELISA操作步驟，采用方陣法確定抗原最佳包被濃度，陰、陽(yáng)性血清最佳稀釋度及判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 雜交瘤細(xì)胞的融合、篩選、克隆和腹水制備

取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，按5：1的比例在PEG4000的作用下融合，將融合后的細(xì)胞低速離心后棄上清，用10 mL37 ℃預(yù)溫含HAT的1640培養(yǎng)液重懸，加入事先加有90 ml飼養(yǎng)細(xì)胞懸液的100 mL鹽水瓶中，混合均勻后滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μ l。置5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。融合后第3～4d用含HAT1640培養(yǎng)液半量換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)到占孔底1/3時(shí)，取上清用間接ELISA試驗(yàn)方法進(jìn)行篩選。選取PCV2-ORF2反應(yīng)陽(yáng)性而PGEX-KG反應(yīng)陰性且細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛形態(tài)好的孔，用有限稀釋法進(jìn)行克隆。對(duì)抗體陽(yáng)性孔采用有限稀釋法克隆3次后，擴(kuò)大培養(yǎng)收集上清，取約1×106雜交瘤細(xì)胞腹腔注入預(yù)先注射不完全佐劑7d 的6～8周齡BALB/c小鼠制備腹水。7～10 d后，無(wú)菌采集腹水，離心，經(jīng)檢測(cè)后分裝，置-20℃凍存?zhèn)溆谩ｊ?yáng)性雜交細(xì)胞瘤擴(kuò)大培養(yǎng)后，加入細(xì)胞凍存液保存在液氮中。

1.2.5 特異性鑒定

（1）Western-blot鑒定

PRRSV-NSP2重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠中的重組蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。以小鼠腹水為一抗，HRP羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western-blot鑒定。同時(shí)用抗PRRSV-NSP2的小鼠陽(yáng)性血清作為陽(yáng)性對(duì)照。

（2）間接免疫熒光試驗(yàn)

分別用用PRRSV J X A1、CH1A株感染24孔培養(yǎng)板中的MARK-145細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用300mmolD-氨基葡萄糖處理30 min，然后用PBS洗三次，再培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞棄上清，用PBS洗三次再用甲醇固定細(xì)胞，室溫放置10 min，用PBS洗三次，再用10%牛血清封閉，37℃，30 min。用PBS洗三次加入小鼠腹水（1：100稀釋），37℃，60 min，PBS洗三次，加入異硫氰酸熒光素（Fluorescein isocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1：200稀釋）37 ℃孵育30 min，用PBS洗三次置熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)不接毒的正常細(xì)胞對(duì)照。用免疫鼠和空白鼠血清分別做為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。有綠色熒光者判為陽(yáng)性，無(wú)熒光者判為陰性。

1.2.6 雜交瘤細(xì)胞株的特性鑒定

（1）單抗的亞類鑒定

依據(jù)Thermo公司產(chǎn)品說(shuō)明書操作，采用間接ELISA法鑒定。

（2）單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法測(cè)定。將單克隆抗體上清以及腹水倍比稀釋后，分別以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和SP2/0腹水為陰性對(duì)照，以P/ N ≥2.1時(shí)的最高稀釋倍數(shù)為效價(jià)判定終點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 Nsp2 基因的克隆與表達(dá)

原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果：

圖1 pet28a-nsp2的酶切鑒定結(jié)果

圖5 pET28a-Nsp2表達(dá)產(chǎn)物的純化

2.2 間接ELISA 方法的建立

以pET28a-Nsp2蛋白為ELISA抗原，分別與小鼠標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行方陣滴定，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)。方陣滴定結(jié)果方陣滴定結(jié)果顯示：血清的最佳稀釋倍數(shù)為1：800，可溶性蛋白的最佳稀釋度為1：800（蛋白含量為1875ng/ml）。用于單克隆抗體篩選之用的羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體工作濃度為1：5000。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立

經(jīng)純化NSP2蛋白免疫的BABL/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0經(jīng)PEG4000融合后，通過(guò)間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，獲得1株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。命名為A2F1，這株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)3次亞克隆后，100%的檢測(cè)孔保持了分泌抗pET28a-Nsp2蛋白抗體的能力。

2.4 單抗的特異性鑒定

2.4.1 單抗的亞型鑒定

采用抗體檢測(cè)試劑盒測(cè)定McAb亞型，鑒定其抗體蛋白亞型。鑒定結(jié)果表明，重鏈為IgG1型，輕鏈為κ鏈。

2.4.2 單抗效價(jià)的測(cè)定

采用間接ELISA法測(cè)得單抗的細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)為1：800，腹水效價(jià)分別為1：12800。

2.4.3 Western blot鑒定

Western blot 分析表明，A2F1單抗與pET-Nsp2 蛋白在預(yù)期位置83kDa處有特異性反應(yīng)條帶出現(xiàn)，而與pET28a 對(duì)照未見(jiàn)反應(yīng)條帶。

2.4.4 間接免疫熒光法鑒定單克隆抗體的特異性結(jié)果

A2F1可以和PRRSV（JXA1株）Marc-145細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，A2F1不能與PRRSV（CH1A株）Marc-145細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)。

3 討論

Nsp2 蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒在復(fù)制的過(guò)程中產(chǎn)生的一種RNA復(fù)制酶，在完整的病毒粒子中不存在，因此用PRRSV全病毒免疫小鼠不能使小鼠產(chǎn)生針對(duì)nsp2蛋白的抗體。首先，Nsp2是一個(gè)復(fù)合功能蛋白，具有 3C 樣半胱氨酸蛋白酶活性，且這一區(qū)域具有順式以及反式切割活性[4]。其次Nsp2 是PRRSV基因組中變異最大的一個(gè)基因，且變異主要集中在中部區(qū)域[4]。由于HPPRRSV（JXA1）nsp2 基因較大，表達(dá)整個(gè)基因組比較困難，所以王海燕等[4]，武佳斌等[5]以及Yan等[6]只是選擇性的表達(dá)了免疫原性較強(qiáng)的一小段基因。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)截去NSP2基因 C 端跨膜區(qū)的疏水序列，在沒(méi)有破壞nsp2表位序列以及不影響其免疫原性的情況下。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列，利用表達(dá)效率較高的原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒并進(jìn)行了原核表達(dá)。用豬抗PRRSV血清抗體進(jìn)行Western-bolt 鑒定，結(jié)果表明，融合表達(dá)的pET28adnsp2蛋白能被 PRRSV 陽(yáng)性血清特異性識(shí)別。

在單克隆抗體制備過(guò)程中，抗原的純度是制備特異性單克隆抗體的技術(shù)關(guān)鍵，用純度低的抗原不僅給篩選針對(duì)目的抗原的單抗帶來(lái)麻煩，也會(huì)影響抗體的產(chǎn)生[5]。在實(shí)驗(yàn)初期通過(guò)低溫誘導(dǎo)可以使蛋白以可溶性方式表達(dá)，但是在過(guò)鎳柱純化的過(guò)程中蛋白的得率以及純度都不理想只能通過(guò)提包涵體的方法提高它的純度與得率，從而降低了非特異性的產(chǎn)生減少了工作量。Li[7]等將我國(guó)最新分離的 PRRSV JXA1和SY0608株與美洲標(biāo)準(zhǔn)毒株 VR2332 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn) NSP2 基因有30aa缺失，同樣與在我國(guó)流行的PRRS毒株CH1A相比也有30aa缺失，而Zhou，L[8]等發(fā)現(xiàn)缺失的30aa與毒株的毒力并沒(méi)有太大的相關(guān)性。特異性試驗(yàn)表明，本試驗(yàn)獲得的Mabs與NSP2蛋白有特異性反應(yīng)，說(shuō)明獲得的Mab具有高度的特異性，而與標(biāo)準(zhǔn)美洲型毒株CH1A不反應(yīng)，說(shuō)明這這株單抗針對(duì) JXA1株 Nsp2 基因中的非保守區(qū)域，能夠區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)美洲型毒株CH1A和目前流行的高致病性 PRRSV 強(qiáng)毒株，這為建立豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染特異、敏感和快速的檢測(cè)方法及N sp2基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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