孫美莉，劉虎虎，鄔文嘉，任路靜，黃和，紀(jì)曉俊

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

為很多具有生物活性物質(zhì)的前體物質(zhì)，如前列腺素、白三烯和血栓素，這些生物活性物質(zhì)可以有效緩解炎癥、疼痛和發(fā)燒[2]。然而哺乳動(dòng)物，包括人類，只能合成油酸，不能合成亞油酸和亞麻酸，而這兩種多不飽和脂肪酸是人體必需的脂肪酸，必須從食物中獲得。長(zhǎng)期以來(lái)，多不飽和脂肪酸多數(shù)是在深海魚中發(fā)現(xiàn)的，少部分來(lái)自于微藻。由于魚油容易被周圍環(huán)境污染，此外人類對(duì)于多不飽和脂肪酸的需求正在快速增加，目前多不飽和脂肪酸已經(jīng)供不應(yīng)求。因此，急需開發(fā)清潔可持續(xù)的多不飽和脂肪酸資源。近年來(lái)對(duì)于脂質(zhì)積累的研究主要集中于單細(xì)胞微生物，如酵母和微藻[3]。20世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)某些被孢霉屬能在體內(nèi)積累一定量的花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）后，高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株一直被廣泛用于研究ARA的合成[4]，但是利用高山被孢霉大量生產(chǎn)脂質(zhì)存在著一些缺陷，如絲狀真菌生長(zhǎng)緩慢、生物量低。而通過(guò)單細(xì)胞酵母產(chǎn)油脂具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)周期短、適合大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是通過(guò)酵母生產(chǎn)油脂也存在一個(gè)弊端，利用酵母生產(chǎn)的不飽和脂肪酸的不飽和程度很低，因此有必要通過(guò)代謝工程使酵母體內(nèi)不飽和脂肪酸含量大幅度提高。本文介紹了在酵母菌中進(jìn)行代謝工程改造產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展。首先介紹在常規(guī)酵母-釀酒酵母中進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)不飽和脂肪酸的研究，主要考察了一些特定酶的活性及其作用，和對(duì)非常規(guī)酵母-解脂耶氏酵母進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)目標(biāo)PUFA。由于PUFA對(duì)磷脂雙分子層的流動(dòng)性和嵌入其中的蛋白有重要的影響，因此綜述了在酵母菌中積累PUFA對(duì)于細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及細(xì)胞應(yīng)激能力反應(yīng)的影響。最后，對(duì)于在酵母菌中進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)PUFA前景進(jìn)行了展望。

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代謝工程改造酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展

孫美莉，劉虎虎，鄔文嘉，任路靜，黃和，紀(jì)曉俊

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

摘要：多不飽和脂肪酸因其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛作用而得到人們極大的關(guān)注，當(dāng)前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸具有諸多優(yōu)點(diǎn)，由于酵母生產(chǎn)迅速且生物量較高，利用酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。本文綜述了代謝工程改造酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展，以常規(guī)酵母-釀酒酵母和非常規(guī)酵母-解脂耶氏酵母為例，介紹了酵母菌中多不飽和脂肪酸的代謝途徑、酵母產(chǎn)油脂的生化機(jī)制、代謝工程改造酵母產(chǎn)多不飽和脂肪酸以及不飽和脂肪酸積累對(duì)酵母耐受性的影響。以后研究工作的重點(diǎn)是進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的機(jī)理研究，并以此為來(lái)指導(dǎo)代謝工程改造酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸。

關(guān)鍵詞：多不飽和脂肪酸；釀酒酵母；解脂耶氏酵母；代謝途徑；代謝工程

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上C=C且碳鏈長(zhǎng)度為18～22個(gè)碳原子的脂肪酸。根據(jù)第一個(gè)C=C出現(xiàn)在從甲基原子數(shù)起第3個(gè)或第6個(gè)碳原子上，通常分為omega-3和omega-6系列。多不飽和脂肪酸具有多種重要的生理功能，包括可降低冠心病、神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。此外，PUFAs還可以作

為很多具有生物活性物質(zhì)的前體物質(zhì)，如前列腺素、白三烯和血栓素，這些生物活性物質(zhì)可以有效緩解炎癥、疼痛和發(fā)燒[2]。
然而哺乳動(dòng)物，包括人類，只能合成油酸，不能合成亞油酸和亞麻酸，而這兩種多不飽和脂肪酸是人體必需的脂肪酸，必須從食物中獲得。長(zhǎng)期以來(lái)，多不飽和脂肪酸多數(shù)是在深海魚中發(fā)現(xiàn)的，少部分來(lái)自于微藻。由于魚油容易被周圍環(huán)境污染，此外人類對(duì)于多不飽和脂肪酸的需求正在快速增加，目前多不飽和脂肪酸已經(jīng)供不應(yīng)求。因此，急需開發(fā)清潔可持續(xù)的多不飽和脂肪酸資源。近年來(lái)對(duì)于脂質(zhì)積累的研究主要集中于單細(xì)胞微生物，如酵母和微藻[3]。20世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)某些被孢霉屬能在體內(nèi)積累一定量的花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）后，高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株一直被廣泛用于研究ARA的合成[4]，但是利用高山被孢霉大量生產(chǎn)脂質(zhì)存在著一些缺陷，如絲狀真菌生長(zhǎng)緩慢、生物量低。而通過(guò)單細(xì)胞酵母產(chǎn)油脂具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)周期短、適合大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是通過(guò)酵母生產(chǎn)油脂也存在一個(gè)弊端，利用酵母生產(chǎn)的不飽和脂肪酸的不飽和程度很低，因此有必要通過(guò)代謝工程使酵母體內(nèi)不飽和脂肪酸含量大幅度提高。
本文介紹了在酵母菌中進(jìn)行代謝工程改造產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展。首先介紹在常規(guī)酵母-釀酒酵母中進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)不飽和脂肪酸的研究，主要考察了一些特定酶的活性及其作用，和對(duì)非常規(guī)酵母-解脂耶氏酵母進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)目標(biāo)PUFA。由于PUFA對(duì)磷脂雙分子層的流動(dòng)性和嵌入其中的蛋白有重要的影響，因此綜述了在酵母菌中積累PUFA對(duì)于細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及細(xì)胞應(yīng)激能力反應(yīng)的影響。最后，對(duì)于在酵母菌中進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)PUFA前景進(jìn)行了展望。

1 多不飽和脂肪酸的代謝途徑

微生物具有合成脂肪酸的能力，但是合成的脂肪酸鏈長(zhǎng)和不飽和程度主要取決于微生物物種。酵母菌一般只能生成碳鏈長(zhǎng)度不超過(guò)18的脂肪酸，如釀酒酵母主要生產(chǎn)飽和脂肪酸（C16∶0和C18∶0）和單不飽和脂肪酸（C16∶1和C18∶1），不產(chǎn)生任何多不飽和脂肪酸[5]；而在非常規(guī)酵母-解脂耶氏酵母中主要產(chǎn)生單不飽和脂肪酸油酸（C18∶1）和多不飽和脂肪酸亞油酸（C18∶2）[6]。盡管酵母中產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸成分不同，但是酵母菌中PUFA的合成途徑都需氧去飽和酶和延長(zhǎng)酶途徑，只是其所含的去飽和酶或者延長(zhǎng)酶種類和數(shù)量不同導(dǎo)致最終合成的脂肪酸成分的差異。

在酵母菌中，脂肪酸從頭合成始于線粒體中形成檸檬酸，檸檬酸通過(guò)線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。一部分檸檬酸在ATP檸檬酸裂解酶的作用下裂解為合成脂肪酸的基本二碳單位——乙酰CoA，另一部分在細(xì)胞膜上檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[7]。檸檬酸裂解產(chǎn)生的乙酰-CoA通過(guò)脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）生成飽和脂肪酸，再通過(guò)連續(xù)延長(zhǎng)和去飽和反應(yīng)生成多不飽和脂肪酸。圖1總結(jié)了酵母中以葡萄糖為底物，酵母體內(nèi)不飽和脂肪酸合成途徑以及通過(guò)代謝工程手段在酵母體內(nèi)實(shí)現(xiàn)的PUFA生產(chǎn)，如花生四烯酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）合成的路徑，其中所涉及的一系列脫氫酶、去飽和酶和延長(zhǎng)酶已經(jīng)從眾多微生物中分離出來(lái)，這為對(duì)酵母菌進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)PUFA提供了可能[8]。

2 對(duì)酵母菌進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)多不飽和脂肪酸

目前用于合成PUFA的酵母菌種類很多，由于酵母菌種類的不同，其所生產(chǎn)的PUFA鏈長(zhǎng)和不飽和程度也不盡相同，研究情況見表1。

酵母作為單細(xì)胞微生物，具有生長(zhǎng)快、周期短、形態(tài)易控制等特點(diǎn)，美國(guó)杜邦公司（DuPont）通過(guò)對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行代謝工程改造最終實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)EPA，因此出現(xiàn)了兩個(gè)商業(yè)化產(chǎn)品：New Harvest? EPA oil和Verlasso? salm。

2.1 常規(guī)酵母：在釀酒酵母中生產(chǎn)PUFA

圖1 酵母中脂肪酸合成途徑酵母中原本有的脂肪酸途徑用實(shí)線表示；通過(guò)代謝工程在酵母中實(shí)現(xiàn)的途徑用虛線表示

表1 不同酵母產(chǎn)脂肪酸研究概況

相對(duì)于其他酵母來(lái)說(shuō)，釀酒酵母作為模式微生物，其遺傳學(xué)已經(jīng)非常成熟，具有相對(duì)簡(jiǎn)單容易的遺傳操作，且基因組測(cè)序已經(jīng)完成并公開，因此釀酒酵母是一個(gè)極好的用于研究真核生物中脂質(zhì)代謝的遺傳學(xué)，生化機(jī)制以及細(xì)胞生物學(xué)的模式微生物，但是由于釀酒酵母生產(chǎn)脂肪酸的含量很低，目前還不適合作為宿主進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)PUFA。盡管油脂大量積累僅僅發(fā)現(xiàn)在一些產(chǎn)油酵母（如解脂耶氏酵母Ya r ro wia lip o ly tic a，圓紅冬孢酵母Rhodosporidium yeast）、真菌（如破囊壺菌Thraustochytrium aureum、裂殖壺菌Schizochytrium limanium）以及微藻（如隱甲藻Crpythecodinium cohnii）中，但是在非產(chǎn)油酵母釀酒酵母中的脂肪酸生物合成途徑和產(chǎn)油酵母是相似的。因此可以利用釀酒酵母成熟的遺傳操作系統(tǒng)，通過(guò)在釀酒酵母中導(dǎo)入特定編碼某種酶的基因以增加特定某種脂肪酸的含量，從而更好地研究脂質(zhì)積累潛在的生化機(jī)制。RUENWAI等[15]通過(guò)在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)來(lái)自魯氏毛霉的?12去飽和酶和?6去飽和酶基因，研究合成的PUFA及其整合到細(xì)胞膜上對(duì)細(xì)胞活性以及氧化應(yīng)激能力的影響，發(fā)現(xiàn)酵母中積累的PUFA會(huì)降低細(xì)胞氧化應(yīng)激的能力以及降低蛋白酶體的活性，不利于細(xì)胞的存活，這對(duì)改造工程菌株有重要的參考價(jià)值。CHUANG等[16]將人類延長(zhǎng)酶基因?qū)氲结劸平湍钢?，發(fā)現(xiàn)共軛亞麻酸（conjugated linoleic acid，CLA）對(duì)脂肪酸合成路徑中亞油酸（linoleic acid，LA）延長(zhǎng)到二十碳二烯酸（eicosdienoic acid，EDA）有顯著的抑制作用，從而抑制了LA延長(zhǎng)到ARA的替代路徑，因此可以用CLA有效調(diào)節(jié)亞麻酸代謝。

現(xiàn)在已經(jīng)從眾多的微生物中克隆并鑒定了大量編碼脫氫反應(yīng)和延長(zhǎng)反應(yīng)的酶基因，這使得在酵母中重構(gòu)PUFA合成路徑成為可能。很多研究者通過(guò)代謝工程手段改造釀酒酵母，然后在培養(yǎng)基中添加外源脂肪酸從而實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中PUFA的生產(chǎn)。BEAUDOIN等[17]在釀酒酵母中異源表達(dá)秀麗隱桿線蟲的延長(zhǎng)酶基因，高山被孢霉?5脂肪酸去飽和酶和紫草科?6脂肪酸去飽和酶，通過(guò)外源添加0.5mmol/L的亞油酸為底物生產(chǎn)ARA，0.5mmol/L 的α-亞麻酸（alpha linolenic acid，ALA）為底物生產(chǎn)EPA，在25℃條件下培養(yǎng)4天，ARA和EPA含量達(dá)到總脂肪酸的0.25%和0.2%。YAZAWA等[18]將分離自克魯維酵母的?12脂肪酸去飽和酶和ω3-脂肪酸去飽和酶在釀酒酵母中異源表達(dá)，?12去飽和酶（又名FAD2）催化油酸產(chǎn)生LA，ω3-脂肪酸去飽和酶（又名FAD3）催化LA產(chǎn)生ALA。改造的釀酒酵母在沒有外源添加LA的情況下ALA達(dá)到總脂肪酸的0.8%，而外源添加LA后ALA達(dá)到總脂肪酸的8.7%，通過(guò)外源添加LA可極大增加ALA的產(chǎn)量。YAZAWA等[19]通過(guò)在釀酒酵母中異源表達(dá)來(lái)自克魯維酵母的?12脂肪酸去飽和酶、兔的?6脂肪酸去飽和酶和延長(zhǎng)酶基因，?12去飽和酶催化油酸產(chǎn)生LA，?6去飽和酶催化LA生成γ-亞麻酸（Gamma linolenic acid，GLA），延長(zhǎng)酶催化GLA生成雙高亞麻酸（double gamma linolenic acid，DGLA），從而實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中不外源添加脂肪酸而產(chǎn)生DGLA。改造的工程菌在氮源限制的基本培養(yǎng)基中，在15℃條件下培養(yǎng)7天，DGLA產(chǎn)量占總脂肪酸的2.74%。這是通過(guò)代謝工程改造釀酒酵母，在沒有外源添加脂肪酸的條件下生產(chǎn)PUFA的首次報(bào)道。盡管在釀酒酵母中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了PUFA合成途徑的構(gòu)建，但是脂肪酸的含量比較低，因此釀酒酵母中合成PUFA還有待進(jìn)一步研究。

2.2 非常規(guī)酵母：在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)PUFA

除了釀酒酵母，非常規(guī)酵母——解脂耶氏酵母能夠產(chǎn)油脂，占細(xì)胞干重的20%以上，也被稱為產(chǎn)油酵母。解脂耶氏酵母已被FDA認(rèn)證為安全的，并且已用于工業(yè)化生產(chǎn)有機(jī)酸和單細(xì)胞蛋白。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，CLIB122、WSH-Z06和Po1f 這3個(gè)菌株的基因組序列已經(jīng)完成[20]。解脂耶氏酵母CLIB89已經(jīng)有部分基因組序列測(cè)得并可在Genolevures網(wǎng)站（http：//www.Genolevures.org/） 獲得。由于其遺傳背景已經(jīng)相對(duì)清楚，因此解脂耶氏酵母是非常規(guī)酵母中用于異源表達(dá)最有吸引力的宿主。

2.2.1 解脂耶氏酵母產(chǎn)油脂的生化機(jī)制

根據(jù)之前的研究表明，產(chǎn)油酵母積累油脂主要發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)元素被限制而碳源過(guò)量（如葡萄糖）的階段。很多因素可以誘導(dǎo)解脂耶氏酵母進(jìn)行油脂積累，而氮源限制是最容易控制、最常用也最有效的誘導(dǎo)方法。對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)，氮源是合成其繁殖所必需的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸的必要營(yíng)養(yǎng)元素。而碳源被用于合成4種生物體必要的大分子物質(zhì)（碳水化合物、脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)），在氮源被限制的情況下，即細(xì)胞繁殖速度受抑制的情況下，碳源利用也會(huì)逐漸減慢。但是過(guò)量的碳源流會(huì)轉(zhuǎn)向脂質(zhì)合成，從而在產(chǎn)油酵母中開始油脂積累過(guò)程[3]。

在碳源從被用于細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到被用于細(xì)胞中油脂生成的過(guò)程中，核酸和蛋白質(zhì)的合成途徑被抑制，而脂肪酸和三酰甘油的合成途徑被開始誘導(dǎo)進(jìn)行。已經(jīng)有很多研究者對(duì)調(diào)控脂質(zhì)積累過(guò)程中的關(guān)鍵酶展開研究。在大部分產(chǎn)油酵母中，檸檬酸裂解酶和蘋果酸酶是脂肪酸合成過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶。通常認(rèn)為檸檬酸裂解酶提供脂肪酸合成過(guò)程中的二碳單位乙酰-CoA，而蘋果酸酶提供脂肪酸合成過(guò)程中的還原力NADPH。有證據(jù)表明，在產(chǎn)油真菌枝毛霉（Mucor circinelloides）和高山被孢霉（Mortierella alpina）中，蘋果酸酶在提供脂質(zhì)合成過(guò)程所需的還原力NADPH有關(guān)鍵作用[20]，而在解脂耶氏酵母中，蘋果酸酶并不是提供脂質(zhì)還原力的關(guān)鍵酶。DULERMO等[21]研究在解脂耶氏酵母中檸檬酸裂解酶和蘋果酸酶對(duì)于脂肪酸合成的影響，發(fā)現(xiàn)在解脂耶氏酵母中失活編碼檸檬酸裂解酶的基因，將使產(chǎn)油量降低60%～80%，而失活編碼蘋果酸酶的基因，對(duì)脂肪酸合成沒有明顯影響。而最近WASYLENKO等[22]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在解脂耶氏酵母中，蘋果酸酶不是提供NADPH的主要來(lái)源，磷酸戊糖途徑是提供解脂耶氏酵母胞質(zhì)NADPH的主要來(lái)源。

2.2.2 代謝工程改造解脂耶氏酵母生產(chǎn)PUFA

面對(duì)不斷升級(jí)的中美貿(mào)易戰(zhàn)，中國(guó)必須采取必要的措施，以維護(hù)合理、合法利益，為促進(jìn)中美貿(mào)易和平發(fā)展，實(shí)現(xiàn)合作共贏做出貢獻(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，我國(guó)必須更加重視發(fā)展核心科學(xué)技術(shù)，推動(dòng)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型由量變到質(zhì)變的升級(jí)，以實(shí)現(xiàn)在貿(mào)易往來(lái)中，讓中國(guó)出口商品由價(jià)格優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)為科技優(yōu)勢(shì)，把我國(guó)建設(shè)成為具有更大影響的貿(mào)易強(qiáng)國(guó)。從而維護(hù)中美貿(mào)易的共同利益，實(shí)現(xiàn)中美貿(mào)易平等、互利，促進(jìn)中美兩國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展。

野生型解脂耶氏酵母生產(chǎn)的脂肪酸成分主要是軟脂酸、硬脂酸、油酸和亞麻酸。相對(duì)于釀酒酵母，解脂耶氏酵母本身能積累一定量的油脂，并且能生產(chǎn)雙不飽和脂肪酸。因此，對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行代謝工程改造以生產(chǎn)PUFA成為近期的研究熱點(diǎn)（表2）。

杜邦公司通過(guò)對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行代謝工程改造實(shí)現(xiàn)EPA的工業(yè)化生產(chǎn)。XIE等[28]對(duì)40多株不同的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵性能考察，最終選擇對(duì)ATCC#20362 菌株進(jìn)行代謝路徑改造。XIE等[28]首先在解脂耶氏酵母中表達(dá)來(lái)自眾多產(chǎn)PUFA的微生物基因，包括C16延長(zhǎng)酶、?12去飽和酶、?9延長(zhǎng)酶、?8去飽和酶、?5去飽和酶和?17去飽和酶，改造的解脂耶氏酵母體內(nèi)實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸EPA的生產(chǎn)。隨后，為了使EPA含量達(dá)到最大化，研究者通過(guò)過(guò)量表達(dá)這些去飽和酶、延長(zhǎng)酶、轉(zhuǎn)磷酸膽堿酶（Cholinephosphotransferase，CPT）以及刪除編碼過(guò)氧化物酶體的Pex10基因，使酵母最終產(chǎn)多不飽和脂肪酸EPA含量達(dá)到總脂肪酸含量的56.6%[6]。這是目前在酵母中生產(chǎn)PUFA含量最高的工程化菌株，也是第一個(gè)成功應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)EPA的解脂耶氏酵母菌株。TAI等[25]通過(guò)在解脂耶氏酵母中過(guò)表達(dá)二?；视王；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGA）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），一方面過(guò)表達(dá)DGA使合成脂質(zhì)的前體物質(zhì)乙酰CoA大量增加，另一方面過(guò)表達(dá)利用乙酰CoA合成脂肪酸的關(guān)鍵酶ACC，從而以乙酰CoA為中間體形成脂質(zhì)合成推拉策略，使脂肪酸含量大幅增加，脂質(zhì)含量達(dá)到生物量的63%。

表2 代謝工程改造解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪酸研究進(jìn)展

3 不飽和脂肪酸積累對(duì)酵母細(xì)胞膜流動(dòng)性以及應(yīng)激反應(yīng)的影響

酵母細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的積累對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性有很大的影響，而細(xì)胞膜的成分對(duì)于細(xì)胞的應(yīng)激能力起著重要作用。了解不飽和脂肪酸對(duì)酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及應(yīng)激反應(yīng)的影響，一方面可以更好地改善細(xì)胞中不飽和脂肪酸的組成，從而提高細(xì)胞的耐受性，更好地利用酵母菌株進(jìn)行一些必需物的生產(chǎn)；另一方面，由于酵母細(xì)胞是真核系統(tǒng)，因此對(duì)酵母中不飽和脂肪酸積累影響的研究可以為包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的真核生物中不飽和脂肪酸積累影響提供一些新的見解。

之前已經(jīng)有研究表明，不飽和脂肪酸對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的抗性有明顯的影響。STEELS等[29]對(duì)釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間的熱應(yīng)激以及氧化應(yīng)激，然后監(jiān)測(cè)細(xì)胞的存活率，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜中飽和脂肪酸成分更高的酵母細(xì)胞比細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸成分更高的細(xì)胞抗性更強(qiáng)。這可能是細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸酯化生成了過(guò)氧化物和自由基，從而改變了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響了細(xì)胞膜的屏障作用[30]。RUENWAI等[15]通過(guò)在釀酒酵母中過(guò)量表達(dá)來(lái)自魯氏毛霉的?6去飽和酶和?12去飽和酶，釀酒酵母細(xì)胞中合成了多不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸，合成的多不飽和脂肪酸整合到細(xì)胞膜上后導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激能力和對(duì)抗蛋白毒性壓力的能力降低。

不飽和脂肪酸的積累除了對(duì)氧化應(yīng)激能力起重要的影響，也能加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)乙醇耐受性和堿性環(huán)境的抗性[31]。油酸、棕櫚油酸是酵母細(xì)胞膜中重要的脂肪酸，它們可以改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和屏障作用，細(xì)胞膜適宜的流動(dòng)性是維持細(xì)胞正常生理功能所必須的。為了研究不飽和脂肪酸與釀酒酵母乙醇耐受性的關(guān)系，KAJIWARA等[32]通過(guò)代謝工程手段在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)OLE1基因，由于酵母中過(guò)量積累二烯脂肪酸（dienoic fatty acids），細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量增加，釀酒細(xì)胞的乙醇耐受性比野生型酵母增加。刑建宇等[33]在培養(yǎng)基中分別添加油酸、棕櫚酸和硬脂酸，發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸（如棕櫚酸、硬脂酸）和不飽和脂肪酸（如油酸）都能提高乙醇耐受性，其中油酸的作用更為明顯。隨著研究的深入，將會(huì)涌現(xiàn)更多不飽和脂肪酸對(duì)于酵母細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)以及乙醇耐受性的機(jī)理研究成果，為通過(guò)代謝工程手段獲得具有高效生產(chǎn)效率的酵母菌株奠定理論基礎(chǔ)。

4 展 望

由于PUFA的生理及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及已經(jīng)從眾多微生物中分離并鑒定大量涉及PUFA生產(chǎn)的基因，近年來(lái)越來(lái)越多的研究集中在微生物來(lái)源的單細(xì)胞油脂上，如酵母和微藻[34]。釀酒酵母由于可操作性強(qiáng)，遺傳系統(tǒng)研究的比較成熟，研究者利用釀酒酵母研究了真核生物系統(tǒng)的產(chǎn)油機(jī)制，但其產(chǎn)油量偏低，尚不適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。相對(duì)于釀酒酵母來(lái)說(shuō)，解脂耶氏酵母不僅能產(chǎn)生大量的油脂，還能有效利用廉價(jià)的疏水性底物，因此最近越來(lái)越多的研究集中在利用解脂耶氏酵母進(jìn)行多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)。

盡管酵母能生產(chǎn)PUFA，但是其脂肪酸含量相對(duì)較低，不飽和程度也較低。因此通過(guò)代謝工程手段改造酵母菌株以生產(chǎn)更高含量的PUFA是很有必要的。今后研究可以從以下幾個(gè)方面展開。

（1）進(jìn)一步研究脂肪酸合成過(guò)程中所涉及的關(guān)鍵酶，將其分離克隆并鑒定，為利用代謝工程手段改造酵母菌株合成PUFA奠定基礎(chǔ)。

（2）深入研究酵母中碳流的不同流量，通過(guò)代謝工程技術(shù)改變碳流的流向，使其更多地流向脂肪酸合成。

（3）利用合成生物學(xué)手段，在酵母體內(nèi)組裝與優(yōu)化多不飽和脂肪酸代謝途徑，協(xié)調(diào)底盤細(xì)胞與代謝途徑的適配性，實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的高效合成。

（4）利用酵母產(chǎn)油的積累機(jī)制指導(dǎo)發(fā)酵，使代謝流更多地流向脂肪酸合成，進(jìn)一步提高脂肪酸合成效率。

參 考 文 獻(xiàn)

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·技術(shù)信息·

浙江力普公司納米鈣粉碎成套生產(chǎn)線上榜嵊州市首屆十佳創(chuàng)新項(xiàng)目

第一屆嵊州市創(chuàng)客、創(chuàng)新項(xiàng)目大賽日前圓滿結(jié)束。國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)，中國(guó)粉碎技術(shù)領(lǐng)航者——浙江力普粉碎設(shè)備有限公司參賽的“納米鈣粉碎成套生產(chǎn)線”脫穎而出，榮獲十佳創(chuàng)新項(xiàng)目。至此納米鈣粉碎成套生產(chǎn)線已獲得國(guó)家發(fā)明專利、浙江省新產(chǎn)品和省科技創(chuàng)新項(xiàng)目，中國(guó)無(wú)機(jī)鹽工業(yè)協(xié)會(huì)碳酸鈣行業(yè)分會(huì)、中國(guó)碳酸鈣協(xié)會(huì)行業(yè)專家組聯(lián)合頒發(fā)的碳酸鈣生產(chǎn)節(jié)能降耗技術(shù)和設(shè)備等多項(xiàng)殊榮。

納米鈣粉碎成套生產(chǎn)線集粉碎、分級(jí)、集料、除塵于一體，高效節(jié)能，環(huán)保，是國(guó)內(nèi)頂尖的粉碎設(shè)備，擁有8項(xiàng)國(guó)家專利。其創(chuàng)新之處在于自主研發(fā)了旋風(fēng)粉碎機(jī)、分級(jí)機(jī)、集料裝置、除塵裝置、回料回風(fēng)裝置等設(shè)備，優(yōu)化布置組成用于納米碳酸鈣粉碎的成套生產(chǎn)線，實(shí)現(xiàn)了粉料超細(xì)粉碎的連續(xù)、高效和清潔生產(chǎn)。該生產(chǎn)線能耗低、噪聲小，其解聚后的納米碳酸鈣的粒徑分布均勻。整條生產(chǎn)線處于封閉狀態(tài)下完成，實(shí)現(xiàn)納米鈣的規(guī)模化生產(chǎn)。

該生產(chǎn)線在業(yè)界廣泛使用多年，暢銷山西、安徽、山東、四川、廣東、江西等省市；遠(yuǎn)銷俄羅斯、日本、中東等國(guó)家和地區(qū)，深受客商的青睞。特別受到國(guó)內(nèi)納米碳酸鈣著名生產(chǎn)企業(yè)、上市公司山西蘭花集團(tuán)的充分肯定，評(píng)價(jià)這條生產(chǎn)線能耗低、產(chǎn)量大、細(xì)度集中、振實(shí)密度好，是進(jìn)行納米碳酸鈣的活化、分散、粉碎處理的理想設(shè)備。

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研究開發(fā)

Metabolic engineering of yeast to produce polyunsaturated fatty acids

SUN Meili，LIU Huhu，WU Wenjia，REN Lujing，HUANG He，JI Xiaojun
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech. University，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

Abstract：Polyunsaturated fatty acids，which play important role in food and medicine and other fields，have gained great attention in recent years. The process for production of polyunsaturated fatty acids by microorganism has its own advantages. Yeast，which has rapid growth and accumulation rate，has become the research spotlight and this work reviews the metabolic engineering of yeast to produce polyunsaturated fatty acids. The biosynthetic pathway of polyunsaturated fatty acids，biochemistry mechanism of lipid accumulation，polyunsaturated fatty acids production through metabolic engineering and the effect of unsaturated fatty acids on yeast tolerance，especially in the model organism of Saccharomyces cerevisiae and non-conventional yeast of Yarrowia lipolytica，were addressed. Future research should be focused on exploring the mechanism of polyunsaturated fatty acids production with yeast，which would guide metabolic engineering of yeast to produce polyunsaturated fatty acids.

Key words：polyunsaturated fatty acids; Saccharomyces cerevisiae; Yarrowia lipolytica; metabolic engineering; biosynthetic pathway

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（21376002，21476111）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131405）、國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2014AA021703）及江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。

收稿日期：2015-07-30；修改稿日期：2015-08-13。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.03.034

中圖分類號(hào)：Q 939.97

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000–6613（2016）03–0872–07

第一作者：孫美莉（1990—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：紀(jì)曉俊，副教授，研究方向?yàn)槲⑸锎x工程。E-mail xiaojunji@njtech.edu.cn。