苑志國，劉舒云，郝春香，黃靖香，張莉，眭翔，孟昊業(yè)，郭維民，王明杰，張雨，彭江，汪愛媛，盧世璧，郭全義

?

脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相半月板支架的制備及其生物相容性的研究

苑志國*，劉舒云*，郝春香，黃靖香，張莉，眭翔，孟昊業(yè)，郭維民，王明杰，張雨，彭江，汪愛媛，盧世璧，郭全義

【摘要】

目的成功制備脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相半月板支架，并與半月板纖維軟骨細(xì)胞結(jié)合研究其生物相容性。

方法聯(lián)合利用濕法粉碎、差速離心等物理方法和胃蛋白酶等化學(xué)方法制備脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)，利用改良 Urist法制備脫鈣骨基質(zhì)，并利用灌注、冷凍干燥等方法分別制備脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架等三種不同的支架，并從組織學(xué)、分子生物學(xué)、生物力學(xué)等方面研究三種支架的異同；原代培養(yǎng)兔半月板纖維軟骨細(xì)胞，并將 P3代的纖維軟骨細(xì)胞分別種植在以上三種支架上，利用掃描電鏡、死/活細(xì)胞染色等觀察細(xì)胞生長情況，并分別在 3、7、14 d 時檢測纖維軟骨細(xì)胞的增殖情況以及分泌膠原和糖胺多糖的含量。

結(jié)果物理化學(xué)聯(lián)合法脫細(xì)胞可以去除半月板中絕大部分的細(xì)胞成分，并且很好地保留正常半月板細(xì)胞外基質(zhì)的膠原以及糖胺多糖成分；脫細(xì)胞半月板基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架三種支架均具有良好的孔隙率，合適的孔徑大小，掃描電鏡結(jié)果顯示纖維軟骨細(xì)胞可以很好地在支架上生長，死/活細(xì)胞染色結(jié)果顯示三種支架均可以維持良好的細(xì)胞活性，但是脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架具有更好的生物力學(xué)特性，脫細(xì)胞半月板基質(zhì)支架和脫鈣骨基質(zhì)/脫細(xì)胞半月板基質(zhì)雙相支架在促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞增殖和維持細(xì)胞表型方面要比單純脫鈣骨基質(zhì)支架更優(yōu)。

結(jié)論脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架具有較好的生物力學(xué)特性，良好的生物相容性，可以促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞增殖，同時也可以維持纖維軟骨細(xì)胞的表型，是一種可以應(yīng)用于組織工程半月板再生的支架。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞外基質(zhì)；關(guān)節(jié)半月板；生物相容性；生物力學(xué)；脫鈣骨基質(zhì)

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(1):4-12

作者單位：100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京市再生醫(yī)學(xué)重點實驗室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室（苑志國、劉舒云、黃靖香、張莉、眭翔、孟昊業(yè)、郭維民、王明杰、張雨、彭江、汪愛媛、盧世璧、郭全義），麻醉科（郝春香）

*同為第一作者

半月板損傷是常見的膝關(guān)節(jié)運(yùn)動損傷之一，而半月板一旦損傷后，難以自行修復(fù)，常規(guī)方法難以徹底治愈此類疾病，組織工程半月板再生技術(shù)是最有希望解決此類問題的方法之一[1]，然而在半月板組織工程方面依然面臨很多困難，其中之一就是支架材料的選擇[2]，本研究創(chuàng)新性的聯(lián)合利用脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)和脫鈣骨基質(zhì)天然材料制備脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相半月板支架，該支架既有利于半月板纖維軟骨細(xì)胞生長的微環(huán)境（脫細(xì)胞半月板基質(zhì)），也有起到支撐作用的骨架（脫鈣骨基質(zhì)），具有更好的生物力學(xué)特性。本實驗通過物理化學(xué)聯(lián)合法脫細(xì)胞制備脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)，聯(lián)合脫鈣骨基質(zhì)構(gòu)建脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架，并對其理化性能和生物相容性進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料及試劑新鮮豬半月板、牛骨若干，250 ml 離心管為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；2.5%雙氧水、鹽酸、無水乙醇、甲苯胺藍(lán)染料、番紅 O染料、蘇木素染液、伊紅染液、苦味酸-天狼猩紅染料購自北京化學(xué)試劑有限公司；Hoechst33258 染料購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.2% II 型膠原酶、胃蛋白酶、0.25% 胰蛋白酶購自美國 Sigma 公司；Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Assay Kit購自美國Invitrogen 公司；DNA 提取試劑盒購自 Tiangen公司；糖胺多糖（GAG）定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；羥脯氨酸定量試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.1.2主要儀器RC-6+ 低溫高速離心機(jī)為德國Thermo 公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)為北京博醫(yī)康技術(shù)公司產(chǎn)品；BH-2 型倒置顯微鏡、IX 70 型熒光顯微鏡均為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；BB5060 型CO2培養(yǎng)箱為德國 Heraeus 公司產(chǎn)品；TCS SP8共聚焦顯微鏡為德國 Leica 公司產(chǎn)品；掃描電鏡為日本 Hitachi 公司產(chǎn)品；生物力學(xué)試驗機(jī)為美國Bose 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)的制備將豬半月板組織剪成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的薄片，酸性氧化電位水清洗 3 次，每次 5 min，雙氧水漂洗3 次，每次 30 min，然后無菌蒸餾水漂洗 3 次，每次 3 min，然后再用無菌 PBS 溶液漂洗 3 次，每次 5 min。用勻漿機(jī)在低溫條件下將剪碎后的半月板組織勻漿，制備半月板漿料，然后加入冰醋酸和胃蛋白酶，4 ℃ 過夜。低溫高速離心機(jī)梯度離心：2000 r/min，離心 10 min，去除沉淀；6000 r/min，離心 10 min，去除沉淀；10 000 r/min，30 min，收集沉淀。再次加入無菌蒸餾水，10 000 r/min 離心，收集沉淀，制備濃度大約為 4% 的脫細(xì)胞半月板基質(zhì)漿料，4 ℃ 保存，備用。

1.2.2改良 Urist 法制備脫鈣骨基質(zhì)取新鮮牛骨若干，無水乙醇脫水 2 h，乙醚脫脂 1 h，風(fēng)干0.5 h，無菌蒸餾水沖洗 3 次，每次 5 min，0.5 mol/L鹽酸脫鈣，蒸餾水沖洗至 pH 為 7.0 左右，無水乙醇脫水 2 h，乙醚脫脂 1 h，通風(fēng)干燥，4 ℃ 保存，備用。

1.2.3脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架的制備將制備好的脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)漿料放入模具中，冷凍干燥獲得脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架；脫鈣骨基質(zhì)冷凍干燥后制備脫鈣骨基質(zhì)支架；將制備好的 4% 的脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)漿料灌注到脫鈣骨基質(zhì)中，使脫鈣骨基質(zhì)的孔隙中充滿脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)漿料，然后冷凍干燥制備脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架。

1.2.4兔半月板纖維軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)取3 ～ 4 周齡的新西蘭大白兔 2 只，麻醉，備皮，消毒鋪單，取膝關(guān)節(jié)縱行切口，暴露關(guān)節(jié)腔，游離半月板，切斷半月板前后角韌帶，無菌取出半月板組織，置入盛有 Hank′s 液的培養(yǎng)皿中，并在超凈臺中去除半月板外側(cè)部分，將半月板內(nèi)側(cè)部分置入無菌玻璃瓶中，用眼科剪將半月板組織剪成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的薄片，再加入 0.2% II 型膠原酶，加入無菌磁珠后放在磁力攪拌器上，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中 40 ～ 60 min，至組織塊被完全消化，加入帶有血清的 DMEM 培養(yǎng)液終止消化，離心后將纖維軟骨細(xì)胞植入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，待生長至 90% 融合時傳代，取 P3代細(xì)胞備用。

1.2.5死/活細(xì)胞染色將 P3代的兔纖維軟骨細(xì)胞分別種植到三種支架上，每塊支架種植大約 8 × 106個細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合體，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 3 d 后，取出，在避光條件下進(jìn)行死/活細(xì)胞染色，觀察三種支架對細(xì)胞的毒性；無菌 PBS 溶液清洗 2 次，加入二乙酸熒光素（FDA）孵育 5 min，去除 FDA，PBS 清洗 2 次，碘化丙啶（PI）孵育5 min，去除 PI，PBS 清洗 2 次，然后進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.6掃描電鏡檢測單純支架掃描電鏡：干燥后噴金直接鏡檢。細(xì)胞-支架復(fù)合物掃描電鏡：2.5%戊二醛固定，梯度無水乙醇脫水，臨界點干燥后噴金鏡檢。

1.2.7生物力學(xué)檢測制備統(tǒng)一規(guī)格的樣品用于力學(xué)測試。壓縮試驗樣品長寬高為 5 mm × 5 mm × 5 mm，拉伸試驗樣品為 5 mm × 3 mm × 1 mm，樣品在試驗前用 PBS 浸潤，壓縮試驗時，最大壓縮20%，壓縮速率為 5 mm/min；拉伸試驗時，在拉伸之前預(yù)加載 0.5 N，拉伸速率也為 5 mm/min；利用生物力學(xué)機(jī)獲得力-位移曲線，然后利用 Origin 8.0 軟件求得應(yīng)力-應(yīng)變曲線，獲得樣品壓縮及拉伸彈性模量。

1.2.8組織學(xué)染色4% 多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切片后染色，三種單純支架切片后分別進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、番紅 O 染色以及 I、II 型膠原免疫組化。細(xì)胞-支架復(fù)合物切片后行 Honchest 染色以及 I 型膠原免疫熒光檢測。

1.2.9DNA 定量分析對半月板脫細(xì)胞前后的DNA 含量進(jìn)行測定，判斷脫細(xì)胞后 DNA 的殘留；并對三種單純支架以及不同時間點細(xì)胞-支架復(fù)合物的 DNA 含量進(jìn)行測定，DNA 含量用以判斷纖維軟骨細(xì)胞的增殖情況，細(xì)胞 DNA 含量的計算為總 DNA（細(xì)胞支架中 DNA 含量）減去本底（單純支架 DNA 含量）。在進(jìn)行 DNA 測量時利用 PicoGreen 熒光法進(jìn)行，具體實驗步驟依據(jù)Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Reagent and Kits 說明進(jìn)行。

1.2.10膠原含量測定羥脯氨酸在膠原蛋白中約占 13.4%，在彈性蛋白中極少，不存在其他蛋白中，因此羥脯氨酸的量能反映膠原的含量。將統(tǒng)一規(guī)格的三種單純支架、不同時間點的細(xì)胞-支架復(fù)合物及其培養(yǎng)液取材（每組 5 個樣本），采用羥脯氨酸法測定不同支架以及細(xì)胞-支架復(fù)合物的膠原含量，具體實驗步驟依據(jù)羥脯氨酸測試盒說明進(jìn)行。纖維軟骨細(xì)胞分泌膠原含量用總含量（細(xì)胞支架復(fù)合物 + 培養(yǎng)液）減去本底（單純支架的含量）表示。

1.2.11糖胺多糖含量測定將統(tǒng)一規(guī)格的三種單純支架、不同時間點的細(xì)胞-支架復(fù)合物及其培養(yǎng)液取材（每組 5 個樣本），利用二甲基亞甲基藍(lán)（DMMB）比色法測定糖胺多糖的含量。實驗步驟依據(jù) GENEMD 糖胺多糖總含量二甲基亞甲基藍(lán)比色法定量檢測試劑盒說明進(jìn)行。纖維軟骨細(xì)胞分泌糖胺多糖含量用總含量（細(xì)胞支架復(fù)合物 + 培養(yǎng)液）減去本底（單純支架的含量）表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS15.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示。統(tǒng)計支架孔隙率、孔徑大小及吸水率時使用單因素方差分析，其余定量實驗結(jié)果均采用兩兩之間獨立 t 檢驗，P < 0.05 時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1物理、化學(xué)聯(lián)合法脫細(xì)胞前后的比較

脫細(xì)胞前后的 Hoechst 染色顯示，脫細(xì)胞前大量的細(xì)胞核存在（圖1A），脫細(xì)胞后細(xì)胞核基本消失（圖1B），DNA 定量分析也顯示脫細(xì)胞后DNA 的殘留量為痕量，DNA 殘留小于 100 pg/mg（圖2A）。脫細(xì)胞前后天狼猩紅染色均顯示有大量很強(qiáng)雙折光性呈黃色或紅色的 I 型膠原纖維，也有部分呈弱折光性的綠色細(xì)纖維（III 型膠原）和少量呈多種色彩疏松網(wǎng)狀分布的 II 型膠原（圖1C、D），同時膠原定量結(jié)果也顯示脫細(xì)胞前后膠原含量的差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P > 0.05）（圖2B）。脫細(xì)胞前后甲苯胺藍(lán)染色均顯示有大量染色陽性（呈紫色）區(qū)域（圖1E、F、G、H），同時糖胺多糖定量分析結(jié)果也顯示脫細(xì)胞前后糖胺多糖含量的差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P > 0.05）（圖2C）。

2.2脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架三種支架物化特性的比較

圖1　脫細(xì)胞前后染色比較(A ～ F 放大 100 倍；G、H 放大 400 倍）Figure 1　The comparison between the results before and after decellularization (A - F magnified 100 times; G, H magnified 400 times)

圖2　脫細(xì)胞前后定量分析[A：DNA 含量的比較；B：膠原含量的比較；C：糖胺多糖含量比較（**P < 0.01）]Figure 2　The quantitative analysis between the results before and after decellularization [A: DNA content; B: Collagen content; C: GAG content (**P < 0.01)]

表1　三種支架的孔隙率、孔徑大小及吸水率的比較Table 1　The comparision of the three different scaffolds for porosity, pore size and water absorption

圖3　三種支架掃描電鏡結(jié)果比較（A：脫細(xì)胞半月板基質(zhì)支架；B：脫鈣骨基質(zhì)支架；C：脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架）Figure 3　The SEM of three different scaffolds (A: DMECM scaffold; B: DBMS scaffold; C: DMECM/DBMS diphasic scaffold)

脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架這三種支架的孔隙率、孔徑大小和吸水率的具體參數(shù)見表1，三種支架的孔隙率均在 90%，孔徑大小均在 100 μm 以上（圖3），可以滿足細(xì)胞種植對支架孔隙率和孔徑大小的要求。三種支架 Hoechst 染色均為陰性（圖4A、B、C），DNA 定量為痕量，三種支架的 DNA 殘留均小于100 pg/mg（圖4M）；天狼猩紅染色結(jié)果顯示：脫鈣骨基質(zhì)支架多為呈強(qiáng)折光的紅色或者黃色的 I 型膠原，脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架及雙相支架除呈強(qiáng)折光的紅色或黃色的 I 型膠原外，還可見部分綠色細(xì)纖維（III 型膠原）及疏松狀纖維（II 型膠原）（圖4D、E、F），膠原定量分析結(jié)果顯示三種支架差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖4N）。番紅O 染色及甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示：脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架及雙相支架均顯示有大量染色陽性區(qū)域（糖胺多糖）（圖4G、I、J、L），而脫鈣骨基質(zhì)支架染色為陰性（圖4H、K），同時糖胺多糖定量分析結(jié)果顯示脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架及雙相支架的糖胺多糖含量均高于脫鈣骨基質(zhì)支架（圖4O）。生物力學(xué)測試結(jié)果顯示雙相支架的壓縮彈性模量高于脫鈣骨基質(zhì)支架，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架，同時拉伸彈性模量也高于脫鈣骨基質(zhì)支架，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架（圖4P、Q）。

2.3半月板纖維軟骨細(xì)胞種植于三種不同支架上時其掃描電鏡、死/活細(xì)胞染色結(jié)果

圖4　三種支架物化特性比較[A、B、C：分別為三種支架的 Hoechst 染色；D、E、F：分別為三種支架的天狼猩紅染色；G、H、I：分別為三種支架的番紅 O 染色；J、K、L：分別為三種支架的甲苯胺藍(lán)染色；M、N、O：分別為三種支架的 DNA、膠原及糖胺多糖定量分析結(jié)果；P、Q：分別為三種支架的壓縮及拉伸彈性模量（DMECMS：脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架；DBMS：脫鈣骨基質(zhì)支架；DMECM/DBMS：脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架）]Figure 4　The comparison of physico-chemical propertys of the three different scaffolds [A, B and C are the Hoechst staining of the three scaffolds; D, E and F are the Sirius red staining of the three different scaffold; G, H and I are the safranine O staining of the three different scaffolds; J, K and L are Toluidine blue staining of the three different scaffolds; M, N and O are the quantitative analysis results of DNA, collagen and GAG content of the three different scaffolds; P and Q are the tensile and compressive properties and the measurement of the in plane elastic moduli of the three different scaffolds (DMECMS refers to decellularized meniscal extracellular matrix scaffold; DBMS refers to demineralized bone matrix scaffold; DMECM/DBMS refers to decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic scaffold)]

掃描電鏡結(jié)果（圖5A、B、C）顯示半月板纖維軟骨細(xì)胞均可在三種支架上良好生長，三種支架表面均可見纖維軟骨細(xì)胞，同時死/活細(xì)胞染色證實半月板纖維軟骨細(xì)胞均可以在三種支架上生長，活細(xì)胞染色可見大量綠色熒光亮點（圖5D、G、J），死細(xì)胞染色可見紅色熒光亮點較少（圖5E、H、K），可說明三種支架都對細(xì)胞毒性很?。ㄆ浠罴?xì)胞比率均可達(dá)到 90% 以上），并且三種支架的活細(xì)胞比率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5M）。

2.4半月板纖維軟骨細(xì)胞種植于三種不同支架上其增殖及分泌膠原、糖胺多糖含量的比較

將 P3代的兔半月板纖維軟骨細(xì)胞種植于三種支架上，分別在 3、7、14 d 時測量纖維軟骨細(xì)胞的增殖及分泌膠原和糖胺多糖的含量。結(jié)果顯示：種植于脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架和雙相支架上的纖維軟骨細(xì)胞其增殖情況優(yōu)于脫鈣骨基質(zhì)支架上的（圖6A）。脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架和雙相支架上的纖維軟骨細(xì)胞在 7 和 14 d 時其分泌膠原的含量高于脫鈣骨基質(zhì)支架上纖維軟骨細(xì)胞分泌的（圖6B、C）；同樣脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架和雙相支架上的纖維軟骨細(xì)胞在 7 和14 d 時其分泌糖胺多糖（GAGs）的含量高于脫鈣骨基質(zhì)支架上纖維軟骨細(xì)胞分泌的（圖6D、E）。

圖5　兔半月板纖維軟骨細(xì)胞（P3）種植于三種不同支架上時掃描電鏡及細(xì)胞活性比較（A、B、C：3 d 時掃描電鏡結(jié)果；D、G、J：3 d 時活細(xì)胞染色；E、H、K：3 d 時死細(xì)胞染色；F、I、L：3 d 時疊加后的圖像；M：細(xì)胞存活率的定量分析結(jié)果）Figure 5　Comparison of SEM results and cell vitality when rabbit meniscus fibrochondrocytes (P3) are seeded in the three different scaffolds (A, B and C show the third day result of SEM since fibrochondrocytes was seeded in the three different scaffolds; D, G and J show live cell staining; E, H and K show dead cell staining; F, I and L are superposition images; M shows the quantitative analysis result of cell vitality)

圖6　兔半月板纖維軟骨細(xì)胞（P3）種植于三種不同支架上 3、7、14 d 時，其細(xì)胞增殖及分泌膠原、糖胺多糖含量（A：三種不同支架上的纖維軟骨細(xì)胞 DNA 含量的比較；B：三種不同支架上的纖維軟骨細(xì)胞分泌膠原含量的比較；C：三種支架上纖維軟骨細(xì)胞分泌膠原與 DNA 含量的比的比較；D：三種不同支架上的纖維軟骨細(xì)胞分泌糖胺多糖含量的比較；E：三種支架上纖維軟骨細(xì)胞分泌糖胺多糖與 DNA 含量的比的比較）Figure 6　The proliferation results and the collagen and GAGs express results of the rabbit meniscus fibrochondrocytes (P3) seeded in the three different scaffolds on the 3 rd,　th and 14 th day (A shows the DNA content after the fibrochondrocytes seeded in the three different scaffolds; B shows the collagen content secretion by the fibrochondrocytes seeded in the three different scaffolds; C is the ratio of collagen to DNA content; D is the GAG content secretion by the fibrochondrocytes seeded in the three different scaffolds; E is the ratio of GAG to DNA content)

3　討論

隨著全民運(yùn)動的興起和車輛數(shù)量的不斷攀升，運(yùn)動損傷和車禍等導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)半月板損傷的患者越來越多，然而，臨床上對于半月板損傷的治療方式相對有限，多采用緩解癥狀的姑息治療，難以徹底治愈，同時同種異體半月板移植又由于匹配困難、來源有限等問題難以在臨床廣泛應(yīng)用[3]。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織工程半月板技術(shù)給半月板損傷帶來了新的希望[4]，然而組織工程半月板支架材料的選擇依然是困擾半月板再生的難題之一。本研究創(chuàng)新性地利用脫鈣骨基質(zhì)和脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)兩種天然材料聯(lián)合作為組織工程半月板的支架材料，半月板細(xì)胞外基質(zhì)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化[5-6]，是半月板纖維軟骨細(xì)胞天然的微環(huán)境[7-8]，在支持、連接細(xì)胞的同時參與和維持半月板纖維軟骨細(xì)胞以及半月板組織的各項生理功能[9-10]，而脫鈣骨基質(zhì)具有天然的三維孔隙結(jié)構(gòu)和較好的生物力學(xué)特性[11]，聯(lián)合利用這兩種天然材料，使半月板支架既具有半月板纖維軟骨細(xì)胞天然的微環(huán)境，又有較好的生物力學(xué)特性，因此，脫鈣骨基質(zhì)/脫細(xì)胞半月板基質(zhì)可能是一種良好的組織工程半月板支架。

本實驗采用物理化學(xué)聯(lián)合法脫細(xì)胞，制備脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)，可以較徹底地去除 DNA 物質(zhì)，并且可以很好地保留半月板天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分。Honchest 染色顯示脫細(xì)胞后 DNA 物質(zhì)清除較為徹底，同時 DNA 定量分析結(jié)果也顯示脫細(xì)胞后 DNA 殘留小于100 pg/mg。甲苯胺藍(lán)染色、番紅 O 染色以及天狼猩紅染色均顯示脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)與天然半月板具有相似的膠原以及糖胺多糖成分，同時膠原以及糖胺多糖定量分析結(jié)果也顯示脫細(xì)胞前后膠原以及糖胺多糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

利用脫鈣骨基質(zhì)以及脫細(xì)胞半月板基質(zhì)制備的脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架，這三種支架均具有良好的孔隙率、孔徑大小以及很好的生物相容性。三種支架的組織學(xué)以及膠原和糖胺多糖的定量分析結(jié)果顯示脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架和雙相支架糖胺多糖含量更多，而三種支架的膠原含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，掃描電鏡以及死/活細(xì)胞染色結(jié)果顯示三種支架均具有良好的生物相容性。生物力學(xué)測試結(jié)果顯示，雙相支架具有更好的生物力學(xué)特性。而從種植于三種支架上的半月板纖維軟骨細(xì)胞在 3、7、14 d 結(jié)果顯示，雙相支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架可以更好地促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞增殖以及分泌膠原和糖胺多糖。

因此，相對于單純脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)支架，脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架具有更好的生物力學(xué)特性以及可以更好地促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞增殖以及分泌膠原和糖胺多糖，是一種良好的組織工程半月板的支架。

參考文獻(xiàn)

[1] Guo W, Liu S, Zhu Y, et al. Advances and prospects in tissue-engineered meniscal scaffolds for meniscus regeneration. Stem Cells Int, 2015, 2015:517520.

[2] Smith BD, Grande DA. The current state of scaffolds for musculoskeletal regenerative applications. Nat Rev Rheumatol, 2015, 11(4):213-222.

[3] Moens K, Dhollander A, Moens P, et al. Meniscal transplantation: still experimental surgery? A review. Acta Orthop Belg, 2014, 80(3):403-413.

[4] Malvankar SM, Khan WS. An overview of the different approaches used in the development of meniscal tissue engineering. Curr Stem Cell Res Ther, 2012, 7(2):157-163.

[5] Brown BN, Chung WL, Pavlick M, et al. Extracellular matrix as an inductive template for temporomandibular joint meniscus reconstruction: a pilot study. J Oral Maxillofac Surg, 2011, 69(12): e488-e505.

[6] Tan GK, Dinnes DL, Myers PT, et al. Effects of biomimetic surfaces and oxygen tension on redifferentiation of passaged human fibrochondrocytes in 2D and 3D cultures. Biomaterials, 2011, 32(24): 5600-5614.

[7] Wu J, Ding Q, Dutta A, et al. An injectable extracellular matrix derived hydrogel for meniscus repair and regeneration. Acta Biomater, 2015, 16:49-59.

[8] Wilusz RE, Sanchez-Adams J, Guilak F. The structure and function of the pericellular matrix of articular cartilage. Matrix Biol, 2014, 39:25-32.

[9] Tan GK, Cooper-White JJ. Interactions of meniscal cells with extracellular matrix molecules: towards the generation of tissue engineered menisci. Cell Adh Migr, 2011, 5(3):220-226. [10] Pereira H, Caridade SG, Frias AM, et al. Biomechanical and cellular segmental characterization of human meniscus: building the basis for Tissue Engineering therapies. Osteoarthritis Cartilage, 2014, 22(9): 1271-1281.

[11] Soicher MA, Christiansen BA, Stover SM, et al. Remineralized bone matrix as a scaffold for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A, 2014, 102(12):4480-4490.

Author Affiliation: Institute of Orthopaedics (YUAN Zhi-guo, LIU Shu-yun, HUANG Jing-xiang, ZHANG Li, SUI Xiang, MENG Hao-ye, GUO Wei-min, WANG Ming-jie, ZHANG Yu, PENG Jiang, WANG Ai-yuan, LU Shi-bi, GUO Quan-yi); Department of Anesthesia (HAO Chun-xiang), Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(1):4-12

·論著·

Preparation and biocompatibility research on the decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic meniscal scaffold

YUAN Zhi-guo, LIU Shu-yun, HAO Chun-xiang, HUANG Jing-xiang, ZHANG Li, SUI Xiang, MENG Hao-ye, GUO Wei-min, WANG Ming-jie, ZHANG Yu, PENG Jiang, WANG Ai-yuan, LU Shi-bi, GUO Quan-yi

【Abstract】

ObjectiveTo manufacture a decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic meniscal scaffold and then integrate it with fibrochondrocytes to investigate the biocompatibility of the materials.

MethodsThe decellularized meniscal extracellular matrix was prepared by physical methods such as the waterproof pulverization and differential centrifugation, as well as some chemical approaches like the pepsin digestion. The demineralized bone matrix was prepareded by the improved Urist method. We utilized infusing and lyophilization methods to construct the decellularized meniscal extracellular matrix scaffold (DMECMS), demineralized bone matrix scaffold (DBMS), and decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic scaffold (DMECMS/DBMS), respectively, and then examined the histology, molecular biology, and biomechanical characters of the three different scaffolds. The rabbit meniscus fibrochondrocytes of passage 3 were seeded in the three different scaffolds, and then evaluated the biocompatibility by scanning electron microscopy (SEM) and Live/Dead staining. The collagen and GAGs secreted by fibrochondrocytes on the three scaffolds were detected on the 3rd, 7th, and 14th day.

ResultsThe physico-chemical decellularization method eliminated most of the cellular elements, and preserved the collagen and GAGs components of the meniscal extracellular matrix. The DMECMS, DBMS and DMECMS/DBMS had appropriate porosity and pore size. The SEM and Live/Dead staining results showed that the fibrochondrocytes could grow in the three different scaffolds and maintain good viability. However, the DMECMS/DBMS had the best biomechanics property, and the DMECMS and the DMECMS/DBMS promoted the fibrochondrocytes proliferation and collagen and GAGs secretion.

ConclusionThe DMECMS/DBMS has good biomechanics property and biocompatibility, and can promote fibrochondrocytes proliferation and collagen and GAGs secretion. In conclusion, it is a good scaffold for meniscal tissue engineering.

【Key words】Extracellular matrix;Semilunar cartilages;Biocompatibile;Biomechanics;Demineralized bone matrix

Corresponding Author:GUO Quan-yi, Email: doctorguo@163.com

收稿日期：2015-09-15

通信作者：郭全義，Email：doctorguo@163.com

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863 計劃）（2012AA020502、2015AA020303）；國家自然科學(xué)基金重點項目（21134004）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81472092）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.003