董占梅，張濤韓梅

（1.吉林省公安廳物證鑒定中心，吉林長春130051；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春130118）

藥用植物萜類生物合成β-AS基因研究進展

董占梅1，張濤2，韓梅2*

（1.吉林省公安廳物證鑒定中心，吉林長春130051；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春130118）

藥用植物中萜類次生代謝產(chǎn)物種類豐富，數(shù)量大，現(xiàn)代藥理活性突出。β-AS作為萜類成分合成過程中的關(guān)鍵酶，對藥用植物萜類活性成分生物合成過程起著至關(guān)重要的作用。本文系統(tǒng)闡述β-AS的生物學(xué)意義、催化機制、β-AS克隆情況、基因結(jié)構(gòu)以及在重要藥用植物中的研究進展。

β-AS；萜類化合物；藥用植物；基因功能

在高等植物和動物體內(nèi)含有多種萜類化合物，其在工業(yè)生產(chǎn)、臨床，醫(yī)療等領(lǐng)域均作為重要原料使用。有研究報道，萜類化合物具有較好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用，如青蒿素是治療瘧疾的特效藥[1]，紫杉醇可用于腫瘤的治療[2]，丹參酮對心血管系統(tǒng)疾病有良好的療效并被制成多個劑型供臨床使用[3]等，以上化合物均為萜類化合物。

通過對萜類化合物的生物合成機理研究及合成途徑相關(guān)基因的研究為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。目前對于MVA途徑中β-AS基因的研究鮮有報道，因此本文對β-AS基因的生物學(xué)意義、催化機制、β-AS克隆情況、基因結(jié)構(gòu)的研究進行綜述。

1 萜類合成途徑中β-AS的生物學(xué)意義

1.1 萜類化合物的生物合成途徑

有研究報道萜類化合物生物合成途徑分為兩個步驟：甲羥戊酸(MVA)和丙酮酸途徑(DXP)、氧化角鯊烯環(huán)化及環(huán)上復(fù)雜官能團的修飾。第一步：由乙酰輔酶A在 3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶催化合成異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。第二步：由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸在脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶和異構(gòu)酶（DXR）作用形成MEP，然后經(jīng)過磷酸化等過程，生成IPP，從而由 IPP聚合成萜類化合物。IPP和DMAPP可縮合形成牻牛兒基焦磷酸（GPP）；經(jīng)法呢基焦磷酸合成酶（FPS）、鯊烯合成酶（SQS）和鯊烯環(huán)氧酶（SQE）催化及一系列中間產(chǎn)物合成2,3-氧化鯊烯[4]，2,3-氧化鯊烯經(jīng)過環(huán)化及環(huán)上復(fù)雜官能團的修飾最終生成各式各樣的萜類化合物[5]。

1.2 β-AS生物學(xué)意義

在植物中，人們通過研究β-AS在植物三萜皂苷合成過程中的作用，認(rèn)為β-AS所催化反應(yīng)在三萜皂苷合成過程中是一個重要反應(yīng)。魏小春等[6]通過研究 β-AS在歐洲山芥三萜皂苷合成量中發(fā)現(xiàn)β-AS在植物三萜皂苷合成過程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。在人參皂苷合成過程中中，達(dá)瑪烷型皂苷是人參主要活性成分，而β-AS催化齊墩果烷型皂苷Ro的生物合成。通過生物技術(shù)抑制人參 β-AS基因表達(dá)，可以使代謝能量主要流向達(dá)瑪烷型皂苷合成支路，進而提高皂苷含量[7]。

2 植物中β-AS克隆情況

Han[8]等從人參中成功分離到細(xì)胞色素家族兩個基因原人參三醇合成酶（CYP716A53v2）、β-香樹素 C-28位羥基化酶（CYP716A52v2），并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生成轉(zhuǎn)基因人參植株，使CYP716A52v2基因過表達(dá)增加齊墩果烷型人參皂苷Ro產(chǎn)量，而采用RNA干擾技術(shù)則使其產(chǎn)量下降，而達(dá)瑪烷型人參皂苷沒有受到影響，因此CYP716A52v2在人參皂苷合成途徑中起著關(guān)鍵作用。CYP716A53v2的mRNA在人參各個部位均有表達(dá)，在重組WAT21酵母中表達(dá)，導(dǎo)致含有原人參二醇的培養(yǎng)基中的原人參二醇生成原人參三醇。通過LC/APCIMS檢測確定其為原人參三醇。CYP716A53v2是催化人參皂苷 Rg1前體物質(zhì)的關(guān)鍵酶[9]。目前，有 40多種 β-香樹素合成酶同源基因在不同植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。

3 植物中β-AS結(jié)構(gòu)及其催化機制

生物合成三萜類皂苷第一步為OSC環(huán)化作用。目前已經(jīng)從各種不同植物中分離得到了4個編碼OSC的基因（β-AS、DS、LS和 CAS）。β-AS編碼的氨基酸具有 β-AS香樹脂合成酶基因家族的保守序列，即DCTAE序列和QW序列比對和進化樹分析表明，該基因與擬南芥β-香樹脂合成酶基因的相似性最高，為74%。

4 部分藥用植物中β-AS的研究

研究者已從人參和豌豆中得到兩個與β-AS相似的酶，人參皂苷合成途徑中 β-香樹素合成酶（β-AS）催化 2,3－氧化角鯊烯生成β-香樹素，經(jīng)過羥基化和糖基化進而生成齊墩果烷型皂苷。Haralampidis[10]等在研究與產(chǎn)物專一性有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)域時發(fā)現(xiàn)，β-AS的Trp259通過齊墩果烷陽離于產(chǎn)生突變，其突變導(dǎo)致五環(huán)三萜類轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸，而產(chǎn)生四環(huán)子調(diào)控 β-香樹脂的合成；高保守的 Tyr261附近的氨基酸殘基易碳骨架的相應(yīng)殘基的突變導(dǎo)致了達(dá)瑪烷型三萜類的合成。

5 展望

隨著分子生物技術(shù)手段的迅速發(fā)展，研究者對基因的認(rèn)識越來越深刻。迄今為止，對于萜類化合物生物合成途徑及其相關(guān)基因都進行相應(yīng)研究。OSCs為一個超基因家族，其中包括β-AS、DS、LS和CAS等，β-AS為其中的一員，2,3-氧化鯊烯在OSCs，酶的催化作用下經(jīng)過環(huán)化及糖基化的修飾生成植物甾醇和三萜類化合物。在藥用植物中萜類化合物代謝合成途徑的以處于較為成熟的階段，為研究藥用植物萜類化合物合成途徑機理奠定了基礎(chǔ)。萜類化合物具有重要的藥用價值和經(jīng)濟價值。明確藥用植物中β-AS的基因的作用機制，有利于闡明帖類化合物在藥用植物中的合成機理，為工業(yè)化生產(chǎn)培育萜類化合物含量較高的植物具有指導(dǎo)意義。通過調(diào)控萜類化合物生物合成途徑來調(diào)控有效成分的合成，能在一定程度上緩解目前中藥資源緊張，利用度低的情況，對于一些經(jīng)濟價值高的植物，還能創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益。

[1]Mann V,Harket M,Pecker I,et al.Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers[J].Nat Biotechnol,2000,18 (08):888.

[2]吳娜,張留,張志平,等.紫杉醇納米制劑的研發(fā)進展[J].世界臨床藥物,2016(08):563-567.

[3]Du G H,Zhang J T.The general situation and progress of the modern research of red sage root(Radix Salviae Miltiorrhizae) [J].Her Med,2004(23):355.

[4]Tansakul P,Shibuya M,Kushiro T et al.Dammarenediol synthase,the first dedicated enzyme for ginsenoside biosynthesis,in Panax ginseng.FEBS Lett,2006,580:5143～5149.

[5]何云飛,高偉,劉塔斯,等.二萜合酶的研究進展[J].藥學(xué)學(xué)報,2011(09):1019-1025.

[6]魏小春,張曉輝,吳青君,等.歐洲山芥皂苷合成關(guān)鍵酶基因 Bv-beta-AS克隆及表達(dá)分析 [J].園藝學(xué)報,2012(05): 923-930.

[7]趙壽經(jīng),侯春喜,徐立新,等.抑制齊墩果烷型人參皂苷合成支路對達(dá)瑪烷型人參皂苷生產(chǎn)能力的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(工學(xué)版)，2011(03):865-868.

[8]Han J Y,Hwang H S,Choi S W,et al.Cytochrome P450 CYP716A53v2 catalyzes the formation of protopanaxatriol from protopanaxadiol during ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng [J].Plant Cell Physiol.2012,53(9):1535-1545.

[9]張濤.生態(tài)因子對人參 CYP716A52v2和 CYP716A53v2基因表達(dá)量及皂苷含量影響[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[10]Haralampidis,K,et al,A new class of oxidosqualene cyclases directs synthesis of antimicrobial phytoprotectants in monocots [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001.98(23):p.13431-6.

國家自然基金（31270371）

R284

A

10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.050

董占梅，吉林省公安廳物證鑒定中心，講師，研究方向：藥用植物分子生物學(xué)研究。

韓梅，博士，長春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥用植物