王忠琴

（輝南縣輝發(fā)城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林通化135100）

傳染性牛支原體肺炎流行的診斷方法

王忠琴

（輝南縣輝發(fā)城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林通化135100）

本文主要探討傳染性牛支原體肺炎流行的診斷方法，分析了輝南縣2013年新引進(jìn)育肥肉牛呼吸道傳染病進(jìn)行病原學(xué)研究?？偨Y(jié)傳染性牛支原體肺炎防治當(dāng)中要找準(zhǔn)原因，加強(qiáng)疾病預(yù)防和飼養(yǎng)管理，早診斷早治療，以此增強(qiáng)傳染病防治效果。

傳染性；支原體肺炎；診斷

牛支原體是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要致病性支原體，目前已證實(shí)該病原體呈世界性分布，可導(dǎo)致牛群發(fā)生多種病癥，致死率高，常規(guī)抗生素治療效果差，且病情容易反復(fù)，犢牛及體弱牛病死亡率高［1］。

1 資料與方法

1.1 樣本采集

采集血液和肺等各種內(nèi)臟器官作為檢查標(biāo)本。采集途徑：重癥病?；蛩篮蟛痪貌∨?，剖檢取樣；依據(jù)養(yǎng)殖戶病情報告剖檢具有典型癥狀病牛取樣；養(yǎng)殖戶直接送檢病牛。

1.2 檢測方法

1.2.1 支原體培養(yǎng)鑒定在PPLO固體培養(yǎng)基（Sigma公司生產(chǎn)）上涂抹小塊組織樣本，操作均在無菌環(huán)境中進(jìn)行，培養(yǎng)基中放置PPLO肉湯粉（BD公司）、瓊脂粉（BD公司）、酵母粉（BD公司），并將于含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并采用光學(xué)顯微鏡觀察。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：支原體菌落形態(tài)發(fā)生變化，液體培養(yǎng)基發(fā)生顏色變化。

1.2.2 支原體種群鑒定在150毫升滅菌水的Ep-pendorf管中放入小塊帶支原體菌落的瓊脂，先煮沸10分鐘，再冰浴1分鐘，行血清分離后取上清作為DNA模板。采用16SrRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pMD18-T中，通過專業(yè)生物工程技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3 細(xì)菌分離鑒定在103kPa高壓下將40克TSA瓊脂與1000毫升蒸餾水混合物蒸氣滅菌，蒸氣20分鐘，制備出TSA固體培養(yǎng)基；在1000毫升蒸餾水中加入TSB粉30克混合，在103kPa高壓下蒸氣滅菌20分鐘，制備出TSB培養(yǎng)基。在無菌操作標(biāo)準(zhǔn)下于TSA固體培養(yǎng)基表面涂抹小塊組織樣本切面，并采用接種環(huán)將組織對樣本劃線于37℃培養(yǎng)過夜，第2天觀察細(xì)菌分離情況、菌落形態(tài)特征。另外，取純化單菌落放置于TSB液體培養(yǎng)基離心（轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，時長30秒），然后行藥敏測驗(yàn)。

1.2.4 牛結(jié)核診斷參照“動物結(jié)核病診斷技術(shù)GB/T18645-2002”鑒定牛結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、牛結(jié)核菌抗酸染色、牛結(jié)核菌培養(yǎng)情況。采用四抗原融合蛋白抗體ELISA進(jìn)行牛結(jié)核抗體ELISA檢測。

1.2.5 泰勒蟲檢測對血涂片進(jìn)行姬姆薩染色并使用光學(xué)顯微鏡觀察，依據(jù)18SrRNA基因序列設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對泰勒蟲感染進(jìn)行鑒定。

1.2.6 藥敏試驗(yàn)對已經(jīng)分離出的細(xì)菌與支原體進(jìn)行藥敏測驗(yàn)，主要方法為藥敏紙片法，使用的試紙（杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)）包括恩諾沙星、氧氟星、潔霉素、頭孢類、氨芐青霉素、氯霉素等。一切操作嚴(yán)格按照規(guī)定進(jìn)行，判斷標(biāo)準(zhǔn)參考說明書。

2 結(jié)果

2.1 病牛臨床癥狀

牛群發(fā)病月齡集中于3月齡至1年左右，多數(shù)于引進(jìn)1周后發(fā)病，發(fā)病品種多為西門答爾牛與本地黃牛的雜交品種。臨床表現(xiàn)：發(fā)熱（體溫42℃）持續(xù)3～4天，食欲不振、毛粗亂無光澤、咳嗽氣喘、腹瀉（糞水樣帶血），伴隨膿性鼻汁、關(guān)節(jié)炎等，犢牛、體質(zhì)較差牛病情更為嚴(yán)重。經(jīng)分析可見主要是病牛胸腔與肺部發(fā)生病理變化。

2.2 支原體檢測結(jié)果

在不含青霉素支原體培養(yǎng)基中檢測顯示為陰性，另外一個培養(yǎng)基中肺組織病料均為支原體分離陽性。在16SrRNA擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn)，牛支原體為所分離支原體，與GenBank中牛支原體16SrRNA序列、無乳支原體16SrRNA序列同源性高達(dá)99%。

2.3 牛結(jié)核檢測結(jié)果

病牛肺組織抗酸染色、結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測均為陰性，后對該地區(qū)育肥肉牛結(jié)核抗體檢測均為陰性。

2.4 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

不同場所的育肥肉牛以及育肥肉牛不同器官組織細(xì)菌分離情況呈現(xiàn)差異。檢出細(xì)菌為：葡萄球菌、鏈球菌、G-短桿菌。

2.5 血樣泰勒蟲檢測結(jié)果

本研究中共采集了30個血樣，22份呈現(xiàn)陽性，血樣環(huán)形泰勒蟲檢出率為（73.3%）；采用顯微鏡深入檢查，發(fā)現(xiàn)不同牛場中育肥肉牛紅細(xì)胞中都存在泰勒蟲。

2.6 藥敏試驗(yàn)

細(xì)菌、支原體耐藥性嚴(yán)重，不同牛場的牛支原體藥敏性存在明顯差異，其中環(huán)丙沙星居于第一位，其次為左氟沙星、四環(huán)素。針對細(xì)菌而言，先鋒V、頭孢拉定、丁胺卡那效果較為理想。

3 結(jié)語

傳染性牛支原體肺炎既可使牛發(fā)生急性呼吸系統(tǒng)疾病，還會導(dǎo)致持續(xù)感染，常與細(xì)菌、病毒協(xié)同作用，導(dǎo)致多種抗生素治療效果差。牛一旦感染，可持續(xù)帶菌成為傳染源，因此早期進(jìn)行干預(yù)有助于傳染病盡早控制，具有重要的臨床意義［2］。早期應(yīng)用抗生素治療效果明顯，可根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用敏感藥物，例如可選擇環(huán)丙沙星，部分菌株可使用四環(huán)素，另外用藥時要保證足夠的劑量和科學(xué)的療程。此外本研究中還發(fā)現(xiàn)牛群中具有較高的泰勒蟲感染率，可采用貝尼爾或咪唑苯脲針對性治療，提高牛群的抵抗力［3］。

綜上所述，傳染性牛支原體肺炎防治當(dāng)中要找準(zhǔn)原因，加強(qiáng)疾病預(yù)防和飼養(yǎng)管理，早診斷早治療，以此增強(qiáng)傳染病防治效果。

［1］段甫美，趙加發(fā)，肖開順，等.牛傳染性支原體肺炎的診治［J］.云南畜牧獸醫(yī)，2012（03）：24-25.

［2］何金箭.傳染性支原體肺炎在肉牛養(yǎng)殖中的診斷［J］.中國畜禽種業(yè)，2015，11（06）：77-78.

［3］李知新，王進(jìn)香，閆小芹，等.寧夏牛支原體肺炎RT-PCR方法的診斷［J］.中國動物檢疫，2012，29（01）：44-45.

S858.23

ADOI編號：10.14025/j.cnki.jlny.2016.18.038

王忠琴，大專學(xué)歷，輝南縣輝發(fā)城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，獸醫(yī)師，研究方向：動物檢疫。