高曉銘，李艷梅，趙要尊，賈利軍，楊英軍（河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南洛陽471003）

多聚半乳糖醛酸酶基因表達(dá)與果實(shí)成熟

高曉銘，李艷梅，趙要尊，賈利軍，楊英軍*
（河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南洛陽471003）

多聚半乳糖醛酸酶（PG）是一種在植物細(xì)胞壁降解中起重要作用的酶。介紹了PG在果實(shí)成熟軟化中的作用，概述了PG基因及其表達(dá)調(diào)控，評(píng)述了乙烯對(duì)PG調(diào)控的影響。

多聚半乳糖醛酸酶；果實(shí)軟化；乙烯

果實(shí)成熟過程是一系列復(fù)雜生理生化反應(yīng)發(fā)生的過程，包括色澤、質(zhì)地、風(fēng)味、呼吸速率、乙烯釋放和其他一些代謝的變化等。在這些變化中，果實(shí)質(zhì)地主要影響果實(shí)品質(zhì)和商品性，直接表現(xiàn)為果肉軟化和硬度下降，是果實(shí)采收和貯藏過程品質(zhì)評(píng)估的重要指標(biāo)，因此，探討果實(shí)軟化機(jī)理日益成為研究的熱點(diǎn)。20世紀(jì)60年代初，研究顯示，多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）與果實(shí)軟化密切相關(guān)[1]；隨后研究表明，該酶是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，主要功能是將果實(shí)細(xì)胞壁中的多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖和醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)軟化[2]；隨著分子生物學(xué)技術(shù)在PG研究中的應(yīng)用，人們對(duì)其有了更深入的認(rèn)識(shí)。綜述近年來PG和果實(shí)成熟與果實(shí)軟化方面的研究進(jìn)展，旨為相關(guān)研究提供更加全面的信息。

1　PG在果實(shí)成熟中的作用

果實(shí)成熟伴隨著細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變。胞壁物質(zhì)降解、果膠-纖維素-半纖維素結(jié)構(gòu)破壞和原果膠分解，共同開啟了果實(shí)成熟軟化的總閘門，PG在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變中起重要作用，通過催化果膠分子的多聚半乳糖醛酸裂解而參與果膠的降解，進(jìn)而促進(jìn)果實(shí)軟化[3，4]，目前已經(jīng)在番茄、蘋果、梨、獼猴桃、香蕉等研究上得到了證實(shí)，果實(shí)成熟軟化與PG活性增強(qiáng)直接相關(guān)。果膠物質(zhì)也只有在PG活化后，才能變成可溶性物質(zhì)[5]。

果實(shí)的成熟軟化是分階段的，在成熟前期，果實(shí)的軟化主要是由于多聚糖降解或纖維素微纖絲代謝引起了細(xì)胞間結(jié)合力下降；而成熟后期，PG則起更重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)綠熟期，PG幾乎沒有活性；隨著果實(shí)發(fā)育，PG活性呈直線上升，當(dāng)果實(shí)全紅時(shí)PG活性達(dá)到最高。但是含有成熟突變體的果實(shí)PG含量很低，果實(shí)變軟很慢或不能變軟。由此可知，PG含量越高，果實(shí)軟化程度越高，硬度越小[4，6]。在桃果實(shí)成熟軟化過程中，PG活性高峰與乙烯躍變高峰同時(shí)出現(xiàn)在成熟期[7]。轉(zhuǎn)PG反義基因番茄5個(gè)時(shí)期的PG活性動(dòng)態(tài)變化結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因果的PG活性始終處于較低水平，PG活性只在全紅期被強(qiáng)烈抑制[8，9]。所有這些研究結(jié)果均表明，PG在果實(shí)成熟前期對(duì)果實(shí)的軟化基本不起作用，在果實(shí)成熟中后期對(duì)果實(shí)軟化作用明顯[3]。

雖然PG是果實(shí)成熟過程中導(dǎo)致細(xì)胞壁降解的主要水解酶，參與果膠降解，在果實(shí)軟化中起關(guān)鍵作用，但也有報(bào)道顯示，PG的作用并不是果實(shí)成熟軟化的唯一因素[3，7，10，11]。PG基因（PG）序列的獲得和反義RNA技術(shù)的應(yīng)用為研究PG提供了最直接的證據(jù)。利用反義RNA技術(shù)研究果實(shí)成熟時(shí)，轉(zhuǎn)基因番茄中反義PG的過量表達(dá)雖然能抑制PG mRNA的積累和酶活性，使內(nèi)切PG活性降低99%以上，但是阻止果實(shí)軟化的效果并不理想。由此可以推斷，引起果實(shí)軟化的因素很多，原因復(fù)雜，可能不只與果膠降解有關(guān)，很可能與降解細(xì)胞壁的所有酶都有關(guān)系[12]。也有研究表明，PG對(duì)于果實(shí)成熟軟化并不是必要的。國外對(duì)幾個(gè)甜瓜品種進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，在果實(shí)成熟軟化過程中并沒有PG的參與[13，14]。梁小娥等[15]報(bào)道，棗采后可溶性果膠不斷增加，原果膠不斷減少，可溶性果膠含量增加，但PG活性呈下降趨勢(shì)，說明果膠物質(zhì)的變化也是鮮棗果肉軟化的原因之一。由于PG在果實(shí)成熟軟化中所起的作用尚未查明，所以PG的研究已成為國內(nèi)研究熱點(diǎn)。

2　PG的調(diào)控表達(dá)差異和多態(tài)性

PG的功能差異與多態(tài)性表現(xiàn)是在長期進(jìn)化中形成的，并與其結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。研究表明，在植物不同發(fā)育階段和不同組織中PG是由多基因家族編碼表達(dá)，植物發(fā)育每一階段中的細(xì)胞壁修飾都與PG表達(dá)情況有關(guān)，同時(shí)有一系列定位于細(xì)胞壁的酶共同參與。目前，已經(jīng)從番茄、桃、蘋果、梨、香蕉、李、杏、葡萄、草莓、鱷梨、柿、橙、番木瓜等果實(shí)中分離出了大量與果實(shí)成熟軟化相關(guān)的PG[16]（NCBI數(shù)據(jù)），對(duì)PG在各種果實(shí)中的表達(dá)研究也有較多報(bào)道[3]。不同的PG在果實(shí)軟化過程中的表達(dá)模式和時(shí)空表達(dá)特性不同。在表達(dá)模式方面，桃的PG（X76735和DQ340809）在溶質(zhì)桃果實(shí)軟化過程中表達(dá)量顯著增加，另外一些PG（AB231902和X77231）在溶質(zhì)桃和硬肉桃中表達(dá)量卻很少[17，18]；孟憲橋[19]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)桃PG在品種中存在多態(tài)性，并且引起成熟后不同品種果實(shí)硬度或質(zhì)地差異是PG序列中堿基T的重復(fù)數(shù)不同、不同水解酶基因表達(dá)與調(diào)控的差異所導(dǎo)致。謝讓金[20]進(jìn)一步從山桃、甘肅桃、光核桃的品種中發(fā)現(xiàn)了85個(gè)PG的SNPs，表明該基因在演化過程中存在豐富的單核苷酸多態(tài)性。類似的研究結(jié)果也在西洋梨中存在[21]。在時(shí)空表達(dá)特性方面，不同基因家族成員編碼的酶存在生物學(xué)性質(zhì)上的差異，如分解特異性、基質(zhì)特異性、氨基酸順序的差異性，同時(shí)也存在一些高度保守的區(qū)域[22]。魏瀟等[23]分析認(rèn)為，引起PG功能差異的原因就是基因結(jié)構(gòu)（包括啟動(dòng)子、內(nèi)含子和編碼區(qū)）變異和進(jìn)化。

3　PG作用與乙烯的相關(guān)性

乙烯和PG都是果實(shí)成熟過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，研究表明，PG的表達(dá)與乙烯的調(diào)控作用有關(guān)[24，25]。在番茄果實(shí)成熟過程中乙烯含量的增加與PG合成的動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，乙烯含量的增加較PG合成早約20 h，對(duì)成熟的番茄綠果實(shí)施用外源乙烯可激發(fā)PG的合成，而將果實(shí)置于低乙烯的環(huán)境中，則延遲果實(shí)成熟和PG合成。由此可見，乙烯合成早于PG的產(chǎn)生，乙烯間接地激發(fā)PG的合成[10，26，27]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，二者之間還存在著復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)作用，如在乙烯合成受阻的突變體番茄Nr中，PG mRNA和PG的水平極低，乙烯作用抑制劑可以抑制PG mRNA的積累。在反義ACC和反義EFE轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中，乙烯合成受到抑制，PG mRNA仍能大量積累，而PG合成受阻，表明PG mRNA的轉(zhuǎn)錄不受乙烯的影響，而翻譯會(huì)受到乙烯的調(diào)控。但Sitrit等[25]認(rèn)為，PG對(duì)乙烯非常敏感，能對(duì)非常低的乙烯水平產(chǎn)生反應(yīng)，轉(zhuǎn)反義ACS番茄果實(shí)產(chǎn)生的極微量乙烯已足夠誘導(dǎo)PG mRNA的積累。寇曉虹等[26，27]研究顯示，PG的轉(zhuǎn)錄和翻譯都受乙烯的調(diào)控，在乙烯缺陷型番茄（轉(zhuǎn)反義ACS）中PG mRNA表達(dá)水平降低了50%以上，并且表達(dá)高峰推后10 d左右，表明乙烯與PG之間存在互作的反饋調(diào)節(jié)作用關(guān)系，認(rèn)為存在共同的控制元件。在果樹上的研究也有類似結(jié)果。Wang等[29]認(rèn)為，獼猴桃果實(shí)中PG表達(dá)與乙烯生成有密切關(guān)系。黃森等[30]研究表明，乙烯吸收劑處理能抑制火柿果實(shí)PG的活性，延緩果實(shí)硬度的下降速率。闞娟等[7]測(cè)定不同成熟時(shí)期雨花桃果實(shí)乙烯釋放量和PG活性的變化，發(fā)現(xiàn)果實(shí)在成熟軟化過程中具有明顯的乙烯躍變高峰，PG活性高峰與乙烯釋放高峰同時(shí)出現(xiàn)于成熟度的后期，可見PG對(duì)乙烯生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在反饋調(diào)節(jié)。也有研究表明，即使乙烯合成受到抑制，PG mRNA仍大量積累，但未檢測(cè)到PG活性，表明mRNA的轉(zhuǎn)錄不受乙烯調(diào)控。Tacken等[31]發(fā)現(xiàn)，endo-PG的表達(dá)受到乙烯和低溫的誘導(dǎo)與調(diào)控?？梢钥闯?，PG活性和作用與乙烯的相關(guān)關(guān)系復(fù)雜。除了乙烯外，在果實(shí)成熟衰老過程中，還有其他激素影響著PG活性，如ABA、多胺、生長素、赤霉素和細(xì)胞分裂素也起著重要的調(diào)控作用[3，32]。

4　結(jié)語

PG是引起果實(shí)成熟與軟化的主要因素之一。近年來，PG克隆與調(diào)控等相關(guān)研究日益成為果實(shí)貯藏研究的重點(diǎn)，許多學(xué)者進(jìn)行了大量探討并取得了一些重要進(jìn)展。人們可以通過反義基因技術(shù)特異性抑制果實(shí)成熟后PG的表達(dá)，創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)。如陳鑫[36]運(yùn)用基因克隆技術(shù)獲得桃PG全序列，并構(gòu)建了其植物表達(dá)載體；郭國寧[37]克隆桃PG的啟動(dòng)子，對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了反義載體。這些研究為下一步研究基因功能、獲得耐儲(chǔ)性新種質(zhì)提供了重要的理論依據(jù)。

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Recent Advance on the Ralationship between Fruit Ripening and Polygalacturonase Gene

GAO Xiao-ming，LI Yan-mei，ZHAO Yao-zun，JIA Li-jun，YANG Ying-jun*
（College of forestry，He憶nan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

Polygalacturonase is a major enzyme responsible for cell wall disassembly in plants.We intro原duced the role of polygalacturonase in fruit ripening，polygalacturonase gene and its modification，the reg原ulation of fruit po1ygalacturonase by ethylene.

Polygalacturonase；Fruit softening；Ethylene

S66

A

1008-1631（2016）02-0051-04

2015-09-14

河南省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目（13A210873）

高曉銘（1990-），河南南樂人，碩士研究生在讀，主要從事果樹生物技術(shù)育種研究。E-mail：1101783135@qq.com。

楊英軍（1968-），河南孟津人，教授，博士，主要從事園藝植物種質(zhì)資源研究。